生物肥料多功能芽孢杆菌的筛选及其作用机理研究

张艳群，来航线，韦小敏，王旭东

(西北农林科技大学资源环境学院，陕西杨凌712100)

生物有机肥是多种有益微生物菌群与有机肥结合形成的新型、高效、安全的微生物－有机复合肥料。施入后能提高肥料利用率，调节植株代谢，增强根系活力和养分吸收能力［1－3］。目前，运用生物肥料中的有益微生物防治植物病害以及生物净化环境已成为研究热点，其中具有产孢功能，耐热和耐干旱的芽孢杆菌越来越为人们所关注［4－6］。

芽孢杆菌是一类好氧和兼性厌氧、产生抗逆性内生孢子的革兰氏阳性杆状细菌或球状细菌。具有抗逆性强、生长快速、适应范围广等优点［7］，加之易于制成粉剂，便于储藏运输，利于实现大规模生产，具有很好的应用前景和极大的开发潜力。

植物病害生防芽孢杆菌的研究开发应用目前已取得了令人瞩目的成就，但仍存很多问题，如功能菌种单一，效果不稳定［8］。目前，国内外的研究主要集中于PGPR类制剂，而且多见于生物防治等领域［9－10］。大多数研究都集中于单一功能生物因子或同一功能的不同生物因子的功能菌群的研究［8］，对芽孢杆菌的研究相对较少，尤其对多功能芽孢菌株筛选或功能芽孢菌株的复配组合研究甚少。因此，本研究以芽孢杆菌的抑病、促生、活化养分及改善微生物区系四个方面为出发点，通过皿内拮抗试验、盆栽促生试验及土壤养分和微生物类群的测定，旨在筛选多功能芽孢杆菌，通过组合得到最优芽孢杆菌组合，为功能型生物有机肥的研发和生产提供理论和实践指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1供试菌株 芽孢杆菌:菌株B05、B06、B09，均为中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)提供的可作为生物肥料开发的功能菌株，分别为蜡状芽孢杆菌 (Bacillus cereus，CICC编号为21688)、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis，CICC编号为63501)和蜡状芽孢杆菌 (Bacillus cereus，CICC编号为21687)，其余的6株芽孢杆菌为侧孢芽孢杆菌B01(Bacillus laterosporus)、枯草芽孢杆菌B02(Bacillus subtilis)、枯草芽孢杆菌B03(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌B04(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌B07(Bacillus subtilis)、纳豆芽孢杆菌B08(Bacillus natto)，均为本实验室分离鉴定及保藏的可用于肥料开发应用的芽孢菌株。

病原真菌:茄镰刀菌F01、镰刀菌F02、尖孢镰刀菌F03、尖孢镰刀菌F04、腐皮镰刀菌F05、腐皮镰刀菌 F06、甜瓜蔓枯病菌 F07、甜瓜根腐病菌F08，均由西北农林科技大学资源环境学院微生物课题组薛泉宏教授提供。F01、F02为土豆致病菌，F03～F06为黄瓜致病菌，F07、F08为甜瓜致病菌。

1.1.2供试植物 小白菜品种“金早生小白菜F1”由陕西秦兴种苗有限公司提供。盆栽试验土壤采自西北农林科技大学试验田，为搂土。

1.1.3供试培养基［11］改良牛肉膏－蛋白胨琼脂培养基(NA)用于芽孢杆菌和病原细菌的培养与保存;牛肉膏－蛋白胨液体培养基(NB)用于芽孢杆菌的液体发酵培养;病原菌真菌培养基(PDA)用于植物病原真菌的培养与保存;高氏一号培养基用于微生物区系分析。

1.2 测定方法

1.2.1 9株芽孢杆菌抗菌谱的测定［12］采用平板对峙培养法，在PDA平板中央接入培养18 h的拮抗芽孢杆菌菌碟(φ=5 mm)，距拮抗细菌四周2 cm处接种培养3～5 d的植物病原真菌菌碟(φ=5 mm)，以平板中央不接种拮抗细菌为对照，28℃ 培养，待对照长满平板时，测量抑菌带宽及拮抗细菌菌落半径，计算抑制率。抑制率(%)=抑菌带宽/拮抗细菌菌落半径×100。

1.2.2 9株芽孢杆菌发酵液拮抗能力的测定［13］将NA斜面培养基上活化18 h左右的芽孢杆菌接入NB液体培养基，37℃ 200 r/min发酵72 h后，4℃15000 r/min离心30 min，收集上清液，并经细菌滤器(孔径0.22 μm)过滤，即得无菌发酵液。采用琼脂块培养法，将芽孢杆菌发酵液倾入冷却45℃ 左右的PDA培养基中，混匀后倒平板，待冷凝后，在平板上接种病原菌碟，以不加无菌发酵液的PDA平板为对照，28℃ 培养5 d，待对照菌落长满平皿2/3时，用十字交叉法测量病原菌菌落直径，计算生长抑制率。抑制率(%)=(对照组菌落直径－处理组菌落直径)/(对照组菌落直径 －原菌碟直径)×100。

1.2.3小白菜生物量的测定［14］采用菌悬液浇灌土壤接种法，将小白菜的种子用无菌水浸种24 h后，播种于装有田间土的盆钵中，10个处理，每个处理20个重复，常规方法育苗，待真叶长出后，将9株芽孢杆菌的菌悬液(×108cfu/mL)分别浇灌于各植株根部土壤，以清水为空白对照。接种后，定期测定地上部分和地下部分鲜重和干重。

1.2.4土壤中养分的测定［15］采集1.2.3中10种处理播种前、种植中期及收获后的鲜、干土样，测定土壤养分状况。土壤pH用DELTA320pH计测定;有机质用重铬酸钾容量法;全氮用凯氏定氮法;速效氮用靛酚蓝比色法;全磷和全钾用NaOH熔融—火焰光度计法;速效磷用钼锑抗比色法，速效钾用NH4OAc浸提—火焰光度计法测定。

1.2.5土壤中微生物类群的测定［16］采用平板菌落计数法，真菌稀释至 10－1、10－2、10－3涂平板，28℃培养 5 d;细菌稀释至 10－4、10－5、10－6涂平板，37℃ 培养24 h;放线菌稀释至10－3、10－4、10－5涂平板，28℃ 培养7 d;芽孢菌数的测定是将细菌稀释度为 10－3、10－4、10－5的试管 80 ℃水浴 30 min后涂平板，37℃ 培养24 h。

1.2.6 9株芽孢杆菌室内相容性试验［17］将9株芽孢杆菌在NA斜面上活化后，制成菌悬液(约108cfu/mL)，分别加入无菌的滤纸片(φ=5 mm)浸泡10 min。取0.1 mL B01菌悬液于新鲜 NA平板上均匀涂布10 min后，将蘸有另外8株芽孢杆菌菌悬液的滤纸片贴在平皿上，28℃ 恒温培养48 h后观察抑菌圈的形成情况。用同样方法验证菌株 B02及其他菌株之间的相容性。

试验数据用Excel 2003和SASS 13.0统计软件进行统计分析，LSD法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 9株芽孢杆菌抗菌谱的测定

通过对峙培养法，对9株芽孢杆菌的抗菌谱进行了测定。由表1和表2可以看出，除菌株B09外，其余8株芽孢杆菌对植物病原真菌均有不同程度的抑制作用。菌株B06和B07抗菌谱最广、拮抗活性最高，对8种病原菌都有抑制作用，B06对7种病原菌的抑菌带宽都大于4 mm，对4株病原菌的R2/R1≥1;B07次之，对4种病原菌的抑菌带宽都大于4 mm，对3株病原菌的 R2/R1≥1。B01、B02、B03和B04分别仅对2种或4种病原菌的抑菌带宽大于4 mm，其中仅3株都对2种病原菌R2/R1≧1;菌株B05仅对2种病原菌有较弱的抑制作用。菌株B08抗菌谱也较广，但抑制作用较弱。

表1 9株芽孢杆菌菌体对8种植物病原菌的抑制能力Table 1 Antagonistic capabilities of the 9 bacillus strains to 8 pathogens

表2 9株芽孢杆菌对8种植物病原菌的抑制作用Table 2 Inhibitory effects of the 9 bacillus strains against 8 pathogens

2.2 9株芽孢杆菌发酵液拮抗活性的测定

通过琼脂块法，进行了9株芽孢杆菌发酵液拮抗活性的测定。由表3可以看出，菌株B02、B04、B06和B07发酵液的抗菌谱最广，对8株植物病原菌都有抑制作用。其中B06和B07的抑菌活性最好。B06对8株病原菌的抑制率为66.7% ～87.5%;B07对8株病原菌的抑制率为55.6% ～81.3%;B02次之，对8株病原菌的抑制率为32.3% ～64.9%。菌株B01、B03、B05和B08分别都对7种病原菌有抑制作用，B09仅对5种病原菌有抑制作用，抑制率范围为2.8% ～51.4%。综合抗菌谱和发酵液拮抗活力的测定结果，得出菌株B06的拮抗活性最高，B07次之。

表3 9株芽孢杆菌无菌滤液对8种病原真菌的拮抗试验结果Table 3 Inhibitory rates of the 9 bacillus sterile fermentation filtrates against 8 pathogens fungi

2.3 9株芽孢杆菌菌悬液处理对小白菜生长的影响

播种前盆栽土壤的基本养分状况:pH 7.3左右、有机质含量38.15 g/kg、全氮1.79 g/kg、速效氮481.28 mg/kg、全磷1.27 g/kg、速效磷304.06 mg/kg、全钾12.48 g/kg、速效钾363.9 mg/kg。

采用菌悬液浇灌土壤法，对不同时期小白菜植株的生长状况进行了测定，表4结果显示，30 d时，B03和B04菌悬液处理的小白菜苗和根的干重与对照差异显著，具有促生作用，苗干重比对照分别增长了36.4%、27.3%。其余各菌株处理与对照无显著性差异或低于对照水平，未表现出促生作用。60 d时，除B02和B08外，其余各菌株菌悬液处理的小白菜苗干重和根干重与对照相比差异性显著，表现出了促生作用。菌株B04、B05、B07和B09菌悬液处理的小白菜苗干重和根干重与对照相比差异显著，苗干重比对照分别增加了44.3%、38.8%、38.2% 和36.4%，促生作用显著。菌株B01、B03和B06促生作用相对较弱，苗干重比对照增加了7.6% ～27.4%。

表4 9株芽孢杆菌菌悬液处理30 d和60 d对白菜苗生长的影响Table 4 Influence of 9 bacillus strain on the growth of cabbage in 30 days and in 60 days

2.4 9株芽孢杆菌菌悬液处理对不同时期土壤养分变化的影响

养分活化的界定:若处理组全量氮、全量磷或全量钾的含量大于或等于对照组的水平，且处理组速效氮、速效磷或速效钾的含量大于对照组的含量，则具有活化氮、磷或钾的作用;反之则不具有活化氮、磷或钾的作用［15］。

通过盆栽试验测定了9株芽孢杆菌菌悬液处理对不同时期土壤养分的活化作用，结果见表5和表6。由表5可以看出，9株芽孢杆菌菌悬液处理30 d时，土壤中有机质含量与对照差异显著，比对照增加了8.1% ～52.2%。菌株 B03、B04、B05、B06和B09菌悬液处理土壤中全氮和速效氮的含量大于或等于对照水平，具有活化氮的作用，菌株B03活化氮的能力最强，活化率为23.2%;9株芽孢杆菌处理的全磷含量都低于对照水平，均无活化磷的作用。菌株B03、B04、B05、B07和 B09菌悬液处理的全钾和速效钾含量显著高于对照水平，具有活化钾的作用，且B05活化钾的能力最强，活化率为26.8%;其次是 B07，活化率为13.5%。

由表6可以看出，9株芽孢杆菌菌悬液处理60 d时，除菌株B01外，其余各菌株处理的有机质含量均高于对照水平，其中B03、B06、B07和 B09菌悬液处理的有机质含量较高为38.2～38.9 g/kg。菌株B01和B06菌悬液处理的全氮和速效氮含量大于或等于对照水平，具有活化氮的作用，且 B06的活化率最高为19.5%。B01和 B09菌悬液处理的全磷和速效磷的含量高于对照水平，具有活化磷的作用，且B09活化率最高为8.4%。菌株B06菌悬液处理的全钾和速效钾的含量大于或等于对照水平，具有活化钾的作用，活化率为21.4%。

表5 9株芽孢杆菌菌悬液处理30 d对土壤养分的影响Table 5 Influence of 30 days treatment of the 9 bacillus suspended liquid on soil nutrients

表6 9株芽孢杆菌菌悬液处理60 d对土壤养分的影响Table 6 Influence of 60 days treatment of the 9 bacillus suspended liquid on soil nutrients

2.5 9株芽孢杆菌对土壤微生物区系的影响

通过盆栽试验测定了9株芽孢杆菌接种不同时期对土壤微生物类群的影响(表7)，由表7可以看出，9株芽孢杆菌菌悬液处理30 d～60 d时，土壤中细菌和放线菌的数量和种类较对照均有增加，分别是对照的6.1～11.6倍和1.2～1.6倍;真菌的数量和种类明显呈减少的趋势，真菌的数量比对照减少了35%～75%。以上结果表明，9株芽孢杆菌菌悬液接入土壤后，使土壤中细菌和放线菌数量增加，土壤中真菌数量减少，减少了病害发生，有利于土壤中微生物菌群的改善，朝平衡的方向发展［18］。

表7 接种9株芽孢杆菌30 d和60 d后小白菜根区土壤微生物的数量Table 7 Microbial quantities in the places of cabbage＇s rhizosphere after inoculated the 9 bacillus strains at the 30 and 60 days

2.6 室内相容性试验

9株芽孢杆菌的室内相容性试验结果为:B06、B08、B09拮抗B01;所有菌株与 B02无拮抗作用;B04、B05、B06、B07、B08、B09 拮抗 B03;B02、B03、B05拮抗 B04;B04、B06、B08拮抗 B05;B03、B05拮抗 B06;B05、B09拮抗 B07;B05拮抗 B08;B04、B06、B07拮抗 B09。由以上结果可以得出9株芽孢杆菌相容的组合有:B01－B02－B03;B01－B02－B05;B01－B02－B07;B01－B04－B07;B04－B06－B07－B08;B02－B06－B07－B08;B02－B05－B09;B02－B08－B09。综合2.1～2.5的试验结果，可以得出最优复配组合为 B01－B04－B07和B04－B06－B07。

3 讨论与结论

在植物病害生防细菌中，芽孢杆菌是最易从土壤和植株中分离得到，并对多种土传真菌病害具有较好防病作用的一类重要细菌。在农业生产中，芽孢杆菌在防病的稳定性、与化学农药的相容性等方面表现出非芽孢细菌所没有的优势。因此，生防芽孢细菌的筛选对农业生物防治极其重要。本研究结果表明，9株芽孢杆菌 B01～B09的菌体和无菌代谢液对8种植物真菌病害有不同程度的抑制作用。菌株B06和B07对植物病原真菌的拮抗作用具有广谱性和高效性。在PDA培养基上，菌株代谢液与培养基1∶4混合倒平板，菌株B06和B07对病原真菌腐皮镰刀菌、甜瓜蔓枯病菌和甜瓜根腐病菌均具有较好的抑制作用，抑制率分别达到 75.3%、87.5%和78.6%。

许多根际防病芽孢杆菌对植物生长有促进作用，它们或者本身具有解磷、固氮解钾等特殊生理功能，可以将物质转化为植物所需的营养成分［19］;或者产生多种生理活性物质刺激调节植物生长;或者通过刺激土壤中某些生理功能微生物的繁殖，加强土壤肥力，间接为寄主植物的生长提供更多养分，使植物处于良好的生长状态［20］。小白菜盆栽试验结果表明，供试的9株芽孢杆菌的大部分菌株对小白菜的生长具有不同程度的促进作用。菌株 B03和B04的促生作用较强，菌悬液处理后能显著增加小白菜生物量，且处理后小白菜根系较对照健壮，能促进植物根系生长，对作物有增产作用。此外，这些芽孢杆菌还具有活化氮、磷和钾的作用。初步可以认为供试芽孢杆菌对小白菜植株的促生作用是由于菌株自身具有解磷、解钾和固氮等特殊生理功能将物质转化为植物所需养分而导致的。

土壤中的微生物繁殖快、数量大、代谢能力强是生态系统中碳、氮、磷、钾等元素的转化因子和重要库源，对平衡生态系统有着极其重要的意义。微生物区系结果分析表明，不同芽孢杆菌处理后，土壤中细菌和放线菌的数量和种类有所增加，真菌的数量和种类有所减少，说明外源接入特定细菌制剂对植株根域细菌和真菌数量会产生强烈影响。细菌在微生物3大类群中数量最多、比例最大，决定着植物根域微生态环境的菌群平衡和物质能量的转化速度。因此，植株根域细菌数量的增加，真菌数量的减少，可促使植株根域土壤由真菌型向细菌型转变，并减少了真菌性病害的发生。拮抗细菌和放线菌数量的增加，可对真菌性土传病害形成防御屏障，促使植株根域微生物菌群朝有利的方向发展［21］。

近年来，国内外对生物肥料的研究不断深入，微生物的种类也更加多元化，但对芽孢杆菌进行多元化的筛选及将具有不同功效的芽孢杆菌进行组合得到全效型和功能型的芽孢菌株或其组合仍然是生物肥料研制中的不足，同时又是一个研究热点。本研究从抑病、促生、养分活化和改善微生物区系四个方面，筛选出了7株具有一种或多种功能的芽孢杆菌，并得到功能组合B04－B06－B07和B01－B04－B07，使微生物菌群在组成和功能上逐渐由单一走向多元化成为可能，为复合生物肥料的研发和生产提供了理论指导，对生物农业的快速发展具有重大意义。

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