TNF-α对卵泡内膜细胞睾酮分泌及细胞增殖的影响

洪 岭，张云香，陈信良

(1.同济大学附属第一妇婴保健院生殖医学中心，上海 200040;2.山东省潍坊市人民医院病理科，山东 潍坊 261041;3.上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院妇科，上海 200030)

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是以性腺轴失调为主的一个复杂的全身性神经-内分泌-代谢网络失控的症候群，其发病机制至今不是十分清楚。目前认为PCOS的发病机制与以下因素有关:肾上腺功能初现亢进、下丘脑神经内分泌功能异常、胰岛素样生长因子异常、胰岛素抵抗、遗传因素等，但任何单一学说都难以全面解释PCOS的所有临床表现和生化、病理改变，PCOS已成为当今妇科内分泌领域的一个研究热点和最复杂难点。近几年，国内外许多文献报道PCOS患者体内的许多炎症因子，如肿瘤坏死因子 α(TNF-α)、C 反应蛋白(CRP)、白细胞介素 6(IL-6)等水平高于正常人群，PCOS的发生、发展与炎症因子具有密切关系[1-12]。PCOS类似糖尿病、动脉粥样硬化等，可能也是一种炎症性疾病。这里的炎症不同于有红、肿、热、痛、发热等表现的急性炎症，而是由人体免疫系统介导的一种慢性、低度的非特异性的亚临床炎症状态或促炎症状态(proinflammatory state)，患者体内的许多炎症因子水平高于正常人群。有学者指出这种慢性，低度亚临床炎症(炎症学说)可能也是PCOS的发病机制之一。那么炎症因子引发PCOS的机制是什么?本研究将通过体外培养的卵泡内膜细胞进一步探讨TNF-α与PCOS发病机制的关系。

材料和方法

一、试剂与仪器

猪重组 TNF-α(prospec)，DMEM/F12(1∶1)培养液(Hyclone)，胶原酶Ⅱ(TBD)，透明质酸酶(Sigma)，胰蛋白酶(Sigma)，胎牛血清 (FBS，杭州四季青)，CFDA SE细胞增殖与示踪检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)，36%乙酸溶液(上海化学试剂公司)，睾酮放射免疫测定试剂盒(北京北方生物技术研究所)。CO2细胞培养箱(HEPA CLASS 100)，倒置荧光显微镜(TE2000-U，Nikon Eclipse)，流式细胞仪(BD FACSCalibur)，γ放射免疫计数器(Gc-911，安徽合肥中国科大中佳公司)。

二、原代猪卵泡内膜细胞的分离和培养

取新鲜的猪卵巢，置于放有双抗的冰生理盐水中(青霉素、链霉素各含80万IU/500 mL生理盐水)，冰盒内保存，于2 h内进行试验。试验时用生理盐水反复冲洗，将卵巢放入平皿中，选取直径约4～6 mm的健康卵泡，在解剖显微镜下用显微解剖剪小心将卵泡对半剪开，使草黄色卵泡液流出，用自制刮匙仔细刮除附着在其表面的颗粒细胞，用显微镊剥离出卵泡内膜(呈帽状)，并用生理盐水反复冲洗数次。将卵泡内膜剪碎，加入酶液[0.25% 胶原酶Ⅱ、0.05% 透明质酸酶、0.05%胰蛋白酶]，置于37℃含5%CO2的培养箱内消化20～50 min，期间每隔10 min用移液管反复吹打以利于卵泡内膜的消化，以适量含血清的培养基终止消化后，以100目不锈钢滤网滤过。以200×g离心5 min，除去酶，生理盐水洗1次。将获取的卵泡内膜细胞悬浮于含10%FBS的DMEM/F12培养基(含1%双抗)内，0.04%台盼兰染色显示活力(＞70%)，待用。

三、卵泡内膜细胞上清液睾酮浓度的测定

采用放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)测定24孔培养板中细胞上清液的睾酮浓度，按照试剂盒说明书，依次加入标准品和样品50 μL、125I标记的睾酮100μL及睾酮抗体100 μL，充分混合;37℃孵育1 h;加入沉淀剂0.5 mL，室温放置15 min，1200 ×g离心 15 min;弃去上清，沥干试管，γ记数器检测。

四、CFDA SE细胞增殖与示踪检测试剂盒的检测原理

CFDA SE的全称为Carboxyfluorescein diacetate，succinimidyl ester，分子式为 C29H19NO11，相对分子质量为 557.47，CAS号码为 150347-59-4。CFDA SE可以通透细胞膜，进入细胞后可以被细胞内的酯酶(esterase)催化分解成羟基荧光素乙酰乙酸(CFSE)，CFSE可以偶发性地并不可逆地和细胞内蛋白的Lysine残基或其他氨基发生结合反应，并标记这些蛋白。在加入荧光探针CFDA SE后大约24 h即可充分标记细胞。被CFDA SE标记的非分裂细胞的荧光非常稳定，稳定标记的时间可达数月。CFDA SE标记细胞的荧光非常均一，比以前使用的其他细胞示踪荧光探针如PKH26的荧光更加均一，并且分裂后的子代细胞的荧光分配也更均匀。由于CFDA SE标记细胞的荧光非常均匀和稳定，每分裂1次，子代细胞的荧光会减弱一半，这样通过流式细胞仪检测就可以检测出没有分裂的细胞、分裂1次的细胞(1/2的荧光强度)、分裂2次的细胞(1/4的荧光强度)、分裂3次的细胞(1/8的荧光强度)以及类似的其他分裂次数的细胞。使用CFDA SE可以检测分裂多达8次或更多次数的细胞增殖。

CFDA SE标记细胞后通常用流式细胞仪进行细胞增殖检测，CFDA SE标记细胞呈绿色荧光，检测时的激发波长可以选择488 nm，此时的发射波长为518 nm，使用流式细胞仪检测时可以采用FL1 detection channel。CFDA SE标记的细胞也可以用荧光显微镜进行观察。CFDA SE标记的细胞无论在体外还是体内都不会使邻近细胞染色。即CFDA SE荧光探针完成标记后不会从一个细胞转移到邻近细胞。

五、猪原代卵泡内膜细胞CFDA SE的标记及培养

将猪卵泡内膜细胞按照CFDA检测试剂盒的说明书完成CFDA标记，用DMEM/F12培养液稀释成1×105/mL细胞悬液，按每孔1 mL加入到24孔培养板中，加入TNF-α，使其终浓度分别为0、10、100 和 1000 pg/mL，0 pg/mL 为对照组，每种浓度梯度均做3复孔。置37℃ 5%CO2培养箱培养48 h后换液，换液72 h后用流式细胞仪检测细胞增殖情况。

六、流式细胞仪检测卵泡内膜细胞增殖情况

常规胰酶消化、DMEM/F12培养液中和胰酶后，从24孔培养板中将每组细胞转移到流式管中，200×g离心5 min，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)再洗涤1次，用PBS稀释到适宜浓度后上机检测。

流式细胞仪(BD FACSCalibur)检测:光源488 nm的氢离子激光，上机前先用标准微球调整仪器，使变异系数在2%以内，上机后收集10000个细胞，荧光强度以对数放大，光散射数据存硬盘，用 FlowJo软件分析每组细胞的平均荧光强度。

七、统计学方法

所有数据采用SPSS 16.0统计软件进行统计分析，数据以表示，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、TNF-α对猪卵泡内膜细胞睾酮分泌的影响

TNF-α浓度为 10、100和 1000 pg/mL 3个试验组，在24、48和72 h 3个时间点分别与空白对照组(不加药组，TNF-α浓度0 pg/mL)相比，每个浓度做3复孔，重复3次。结果显示，在加入 TNF-α 后，24、48和 72 h 3个时间点分别与空白对照组比较，睾酮水平未见明显变化，见表1。

表1 TNF-α刺激下卵泡内膜细胞所分泌的睾酮与对照组的比较 (ng/mL)

二、TNF-α对猪卵泡内膜细胞增殖情况的影响

在TNF-α (100和1000 pg/mL)刺激72 h后，卵泡内膜细胞的平均荧光强度(MFI)与空白对照组(TNF-α 0 pg/mL)相比明显降低(分别为53.2 ±11.59和66.87 ±14.8，P=0.013;47.55 ±7.31 和 66.87 ± 14.8，P=0.001);而 TNF-α(10 pg/mL)与空白对照组(TNF-α 0 pg/mL)相比，没有出现明显变化(60.2 ±9.20和 66.87 ±14.8，P=0.211)。

讨 论

1985年Shalaby把巨噬细胞产生的TNF命名为TNF-α，把 T淋巴细胞产生的淋巴毒素(lymphotoxin，LT)命名为 TNF-β，两者生物学作用极为相似。人的TNF-α基因长约2.76 kb，相对分子质量为17000。TNF-α来源包括各种免疫细胞、内皮细胞、成纤维细胞、表皮细胞和平滑肌细胞等，其中活化的单核巨噬细胞是其主要来源。TNF-α具有广泛的生物学活性，如杀伤或抑制肿瘤细胞;提高中性粒细胞的吞噬能力，增强抗体依赖细胞介导的细胞毒反应(ADCC)功能;抗感染;引起发热，并诱导肝细胞急性期蛋白的合成;抑制病毒的复制;在调节机体组织糖、脂肪代谢中也起重要作用。

杨雪峰等[13]报道无论是PCOS伴肥胖组，还是体重正常PCOS组血浆TNF-α水平均高于正常对照人群。Peral等[14]报道，肿瘤坏死因子受体Ⅱ基因(the tumour necrosis factor receptor superfamily 1B gene，TNFRSF1B)与 PCOS 发病有关。第6外显子部位的M196R(676T→G)变异与其第4内含子CA微卫星重复多态性呈连锁不平衡，M196R出现频率在PCOS组(30.3%)和对照组(15.3%)妇女中比较，差异有统计学意义(P＜0.05);该结果显示，TNFRSF1B第 6外显子M196R多态性与PCOS和高雄激素血症密切相关。

典型的PCOS卵巢组织形态学上会发生如下变化:卵巢双侧硬化性多囊改变，卵巢被膜呈纤维化或胶原化增厚，表面饱满、光滑，呈珍珠白色，体积较正常卵巢增大2～3倍，切面可见卵巢的白膜均匀增厚，皮质区增宽，被膜下有多个直径2～9 mm囊状卵泡或较大储留卵泡囊肿，罕见黄体或白体，卵巢的髓质区增厚，伴有水肿。镜下显示，卵巢的白膜组织呈弥漫性增厚，较正常厚3～4倍，均由胶原化的纤维组织所组成。白膜下有许多不同成熟阶段的卵泡及闭锁的卵泡存在，卵泡内颗粒细胞少而稀疏，卵泡膜细胞增生，卵巢间质有时黄素化，但卵泡无排卵迹象。

本研究发现，在体外培养的卵泡内膜细胞中加入炎症因子TNF-α后，睾酮分泌没有明显变化，但卵泡内膜细胞的增殖能力却加强，说明TNF-α具有促进卵泡内膜细胞增殖的作用，这个功能可能与PCOS患者发生卵巢白膜增厚、卵泡内膜细胞增生病变有关。TNF-α引起细胞增殖的机制与激活如Jun氨基末端激酶(JNK)等信号转导通路有关[15];TNF-α 还可引起胰岛素抵抗(IR)[2]，继而由 IR 参与 PCOS的发生。

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