芹菜素与核酸作用机制的研究＊

郭 蒙，高庆宇，马艳丽，王 晓，李丽敏

（1.中国矿业大学，江苏 徐州 221116；2.潍坊学院，山东 潍坊 261061）

芹菜素（apigenin，API）又名洋芹素、芹黄素，具有抗肿瘤及化疗增敏作用、抗病毒、抗氧化、调节内分泌、对组织、对器官及系统具有保护作用等药理作用［1－2］。核酸（DNA）是组成基因的主要部分，与药物小分子等物质产生作用后，会导致分子结构与功能不同程度的变化，因此，研究DNA与小分子物质的作用在药学、医学及生物学等领域具有相当重要的意义［3－5］。目前研究DNA作用机制的研究主要采用荧光光谱、紫外光谱、电化学、粘度等方法［6－9］，对于黄酮类化合物和DNA间相互作用的研究已有报道［10］，但对于芹菜素与DNA相互作用的研究尚未见相关报道。本文通过电化学法、紫外－可见分光光度法等探索研究了芹菜素与fsDNA之间的作用方式，并对芹菜素与fsDNA之间的结合数、结合常数进行了研究。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CHI－660电化学工作站（上海辰华）；TU－1810紫外可见吸收分光光度计（北京普析）；pHS－3BW酸度计（上海理达）；0.5－0.6mm乌氏粘度计（上海申立）；fsDNA（Sigma公司）；芹菜素（南京泽朗）；其他所用试剂均为分析纯或生物纯，实验用水为去离子水经二次重蒸而得。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA的热变性处理

将一定量的DNA溶液在沸水浴中煮沸30min，然后迅速放在0℃的冰水浴中冷却，即可得到热变性的DNA（ssDNA）。

1.2.2 电化学方法

电极预处理：金电极先在2000目的金相砂纸上仔细研磨，再在麂皮上依次用0.3um、0.05umAl2O3粉末和2次重蒸水的悬糊抛光成镜面，并用1∶1乙醇溶液和二次重蒸水超声清洗，干燥后作为工作电极使用；饱和甘汞电极作参比电极，铂丝作为对电极。

在一系列10mL的比色管中，依次加入一定量的HMTA溶液、API溶液、fsDNA溶液，定容摇匀，稳定15min。以试剂空白作参比，在10mL电解池中、在－0.1～0.5V电位范围内，采用三电极系统，用循环伏安法（CV）或方波伏安法（SUV）以100mV／s的扫描速度扫描，分别记录I～v曲线。

1.2.3 紫外－可见分光光度法

将按上述方法配置好的溶液置于比色皿中，以0.011mol／l的HMTA溶液作参比，分别在240～600nm范围内进行紫外光谱扫描。

2 结果与讨论

2.1 电化学方法

对于一些具有电化学活性的物质，可用循环伏安法来判断DNA与小分子物质之间的作用方式，如果加入DNA后，氧化峰电位负移，证明DNA与小分子物质之间存在静电作用；若加入DNA后，氧化峰电位正移，则两者之间是以嵌入作用相结合的［11－12］。芹菜素与fsDNA相互作用的循环伏安图如图1所示。

图1 芹菜素与fsDNA相互作用的循环伏安图

由图1可见，在0.2V～1.3V的电位范围内，DNA并没有出现特征的氧化还原峰，而芹菜素则在0.966V处出现了一个非常明显的氧化峰，并在0.508V处出现了还原峰，两峰之间的峰电位差ΔE＝0.458V，说明芹菜素在金电极上发生了准可逆的氧化还原反应。当加入fsDNA后，氧化峰电位发生了负移（0.966v→0.946v），说明二者之间的作用不可能为嵌入作用，而可能为静电作用；同时也说明二者之间通过这种作用生成了一种新的物质。

·发现地震产生的地面运动一般随至断层距离的增大而减小，并根据近地表物质的特性以及局部结构（如深大盆地）而变化。

同样的现象在芹菜素与fsDNA的方波伏安图中表现的更为明显（图2）。从图2中可以看出，单独的芹菜素在0.2～1.3V电位范围内仅在1.072V处有微弱的峰电流（ΔIp＝－1.391×10－6A），加入fsDNA后，峰电位发生了负移，由1.072V移动到0.924V，并且峰电流出现了显著增强（从－1.391×10－6A增强到－7.777×10－6A），说明二者之间发生了作用，生成了一种电活性较高的复合物。

图2 芹菜素与fsDNA的方波伏安图

图3 芹菜素与DNA相互作用的紫外－可见吸收光谱图

2.2 紫外－可见分光光度法

图3为芹菜素与DNA相互作用的紫外－可见吸收光谱图。由图3可知，在240nm到450nm范围内，芹菜素分别在323.5nm、291nm处出现了两个特征吸收峰，当加入fsDNA后，芹菜素的紫外－可见吸收峰发生了明显的变化，说明两者发生了作用，并且随着fsDNA浓度的增加，在323.5nm处吸收峰的峰位置基本不变，吸光度略微增大，但另一个吸收峰的峰位置发生了较大变化，最大吸收波长由287.5nm紫移到266.5nm，相应的吸光度由0.409增大到0.86。通常认为吸收峰红移、发生减色效应为嵌入作用［3］，而本实验加入fsDNA后，导致芹菜素的吸收峰紫移，并且产生了增色效应，说明两者之间存在的作用为静电作用。

2.3 盐效应和磷酸盐效应

通常小分子物质与DNA以静电作用或沟槽作用结合时，由于加入的电解质与小分子物质竞争，导致小分子物质与DNA相互作用程度降低，对ΔIp的影响较大；而以嵌入方式作用时，因小分子物质插到DNA的碱基对中，由于碱基的位阻作用，ΔIp的变化不大［13］。分别向芹菜素、fsDNA溶液中，加入不同浓度的NaCl溶液作用20min，用循环伏安法以100mV／s的扫描速度扫描，研究NaCl对芹菜素与fsDNA相互作用的影响，结果见图4。由图可见，氧化峰电流差值ΔIp先随NaCl浓度的增大出现略微升高，当NaCl浓度大于0.015时，ΔIp出现急剧的下降，进一步证明芹菜素与fsDNA之间是以静电作用结合在一起的。

图4 氧化峰电流差值随Nacl浓度的变化曲线

图5 氧化峰电流差值随Na2HPO4浓度的变化曲线

因为Na2HPO4中含有磷酸根，可与fsDNA中带负电的磷酸根基团竞争与芹菜素的结合，如果它们之间为静电作用，则会对峰电流影响很大。分别向含有芹菜素、fsDNA的溶液中加入不同浓度的Na2HPO4溶液作用20min，并用循环伏安法以100mV／s的扫描速度扫描，结果见图5。从图5可知，Na2HPO4溶液的加入对芹菜素的氧化峰电流差值ΔIp影响较大，说明Na2HPO4中的磷酸根与fsDNA之间发生了竞争，降低了fsDNA与芹菜素的结合，导致峰电流降低，进一步证明二者之间存在静电作用。

2.4 结合数与结合常数的测定

［14－15］计算芹菜素与fsDNA相互作用的结合数m和结合常数K。假定芹菜素与fsDNA只形成一种简单的复合物fsDNA－API，则可推出如下公式：

由斜率和截距可求得结合数m＝4.31872≈4，表明fsDNA和芹菜素相互作用后形成1∶4型的分子结合物，由截距求得其结合常数K＝1.31×104L／mol。

3 结论

本文通过电化学法、紫外－可见光谱法研究了芹菜素和fsDNA之间的作用方式，研究发现，二者之间的作用方式是静电作用，这在盐效应、磷酸盐效应的实验中得到进一步证明。芹菜素和fsDNA之间通过静电力结合并生成了一种电活性较高的复合物。同时求得fsDNA与芹菜素的结合数是4，结合常数K＝1.31×104L／mol。

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