纤维素酶辅助提取黄花蒿中青蒿素的工艺条件研究

卢婉怡

广东省食品药品职业技术学校制药系，广东广州 510663

纤维素酶辅助提取黄花蒿中青蒿素的工艺条件研究

卢婉怡

广东省食品药品职业技术学校制药系，广东广州 510663

目的 研究纤维素酶辅助提取青蒿素反应中各条件对提取率的影响。 方法 采用紫外分光光度法测定青蒿素含量，研究酶反应过程中时间、加酶量、温度和pH值对提取率的影响，并使用正交实验方法对提取工艺进行优化。结果 纤维素酶辅助提取青蒿素的最优工艺条件分别是：酶反应时间2 h，纤维素酶用量0.30 g，酶反应温度45℃，酶反应pH值4.5。结论 纤维素酶辅助提取青蒿素的方法能够有效提高提取率。

青蒿素；纤维素酶；提取

青蒿素（artemisinin，C15H22O5）是治疗疟疾的特效药，具有速效、高效和低毒等抗疟性能[1]。目前，青蒿素主要从黄花蒿（Artemisia annua L.）中提取[2]。 近年来，用于天然产物提取的新技术如微波技术、酶技术等迅速涌现，并取得显著的成效[3]。酶技术具有反应效率高、条件温和、专一性强和有效成分破坏少等优点[4]，受到广泛关注。

我国是黄花蒿的主产国，将酶技术应用于青蒿素的提取过程，对提高提取效率、充分利用资源有重要意义。本研究对纤维素酶辅助提取青蒿素的条件进行研究，分析各因素对提取率的影响，并采用正交实验的方法对酶辅助提取工艺进行优化，为纤维素酶在青蒿素提取工艺中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

青蒿药材购于广州市清平中药材市场（生产批号120711），经鉴定为菊科植物黄花蒿的干燥地上部分，药材经粉碎后过40目筛备用。纤维素酶Cellulase T4（来源于绿色木霉Trichoderma viride，生产批号20120922）购自天野酶制剂（上海）有限公司。青蒿素标准品（生产批号A2118）购自百灵威科技有限公司，无水乙醇、95%乙醇、氢氧化钠、乙酸、乙酸钠等试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂公司。

1.2 仪器设备

FW135型中药粉碎机，SHA-2型恒温水浴振荡器，HH-4型恒温水浴锅，752型紫外可见分光光度计，SHZ-D型循环水真空泵。

1.3 方法

1.3.1 纤维素酶辅助提取青蒿素的方法

称取1 g粉碎后的青蒿样品置于100 ml具塞三角瓶中，加入50 ml乙酸-乙酸钠缓冲溶液，先常温下浸泡10 min，再加入一定量的纤维素酶，然后在一定温度下水浴振荡进行酶反应。酶反应结束后，抽滤，将滤饼置于100 ml具塞三角瓶中，加入50 ml无水乙醇，在45℃下水浴振荡1 h，抽滤，取滤液测定青蒿素含量。

1.3.2 青蒿素含量的测定方法

青蒿素仅在紫外区203 nm处有较弱的末端吸收，但与碱反应后，生成一化合物Q292，该物质在292 nm处有最大吸收，可用紫外分光光度法检测[5]。取样品溶液0.5 ml加入95%乙醇4.5 ml，再加入0.2%NaOH 20 ml定容至25 ml，50℃水浴加热30 min，取出快速冷却，在292 nm处测定吸光值，每组测定3个平行样品，取平均值。根据标准曲线换算出青蒿素含量。

2 结果

2.1 青蒿素含量测定的标准曲线

精确称取青蒿素标准样品10 mg，溶于95%的乙醇溶液，定容至100 ml容量瓶中，配制成0.1 g/L的标准溶液。分别取标准溶液 0、1、2、3、4、5 ml， 加 95%的乙醇溶液至 5 ml，再加入 0.2%NaOH 20 ml定容至 25 ml，50℃水浴加热30 min，取出快速冷却，在292 nm处测定吸光值，每组取3个平行样品，取平均值。以青蒿素样品浓度x（g/L）为横坐标，292 nm吸光值y为纵坐标作图，结果见图1。在292 nm下，青蒿素浓度在0～1 g/L的范围内，与吸光值呈良好的线性关系，表明测定方法准确可靠。

图1 青蒿素含量测定标准曲线

2.2 不同酶反应时间对青蒿素提取的影响

按照2.1中的方法，在100 ml具塞三角瓶中加入0.1 g纤维素酶，在45℃下水浴振荡反应，酶反应缓冲液pH值为4.5，反应时间分别为 1、2、3、4、5 h，测定酶辅助提取后样品青蒿素含量。以不加入纤维素酶进行提取的样品中青蒿素含量为100%进行对照，结果见图2。随着时间的延长，青蒿素的提取率逐渐增加，在3 h左右达到最大值，再延长提取酶反应的时间，青蒿素的提取率基本不变。

2.3 不同加酶量对青蒿素提取的影响

按照2.1中的方法，在100 ml具塞三角瓶中分别加入0.1、0.2、0.3、0.4g 纤维素酶，在 45℃下水浴振荡反应，酶反应缓冲液pH值为4.5，反应时间1 h，测定酶辅助提取后样品青蒿素含量。以不加入纤维素酶进行提取的样品中青蒿素含量为100%进行对照，结果见图3。随着酶添加量的增加，青蒿素的提取率逐渐增加，当加入0.3 g的纤维素酶时，达到最大值，再增加酶用量，青蒿素的提取率基本不变。

2.4 不同酶反应温度对青蒿素提取的影响

按照2.1中的方法，在100 ml具塞三角瓶中加入0.1 g纤维素酶，分别在 40、45、50、55℃下水浴振荡反应，酶反应缓冲液pH值为4.5，反应时间为1 h，测定酶辅助提取后样品青蒿素含量。以不加入纤维素酶进行提取的样品中青蒿素含量为100%进行对照，结果见图4。随着温度的增加，青蒿素的提取率呈现先增加后减小的趋势，在酶反应温度为45℃时达到最大值。

图4 不同酶反应温度对青蒿素提取率的影响

2.5 不同酶反应pH值对青蒿素提取的影响

按照2.1中的方法，在100 ml具塞三角瓶中加入0.1 g纤维素酶，在45℃下水浴振荡反应，酶反应缓冲液pH值分别为4.0、4.5、5.0和 5.5，反应时间为1 h，测定酶辅助提取后样品青蒿素含量。以不加入纤维素酶进行提取的样品中青蒿素含量为100%进行对照，结果如图5。酶反应的pH值对青蒿素的提取率基本无影响，在pH值为4.5时，青蒿素提取率达到最大值。

2.6 纤维素酶辅助提取青蒿素工艺条件的优化

在纤维素酶辅助提取青蒿素的过程中，酶反应时间、酶的添加量和酶反应温度对青蒿素的提取影响较大，而酶反应过程中缓冲液的pH值对青蒿素的提取基本无影响。因此，选取酶反应时间、酶添加量和反应温度作为主要影响条件，利用试验设计软件Design expert 7.5作三因素两水平正交实验L4（23），正交实验水平见表1。

表1 正交实验水平表

按照软件设计的正交实验表中各因素水平，开展实验，然后对试验结果进行分析。正交实验表和结果分析见表2。对实验结果进行极差分析表明：酶辅助提取反应各条件对提取率的影响试验中，酶反应时间（A）的最优值为水平1，酶添加量（B）的最优值为水平2，温度（C）的最优值为水平2，实验中各因素对辅助提取反应的影响顺序为：酶反应时间>酶添加量>温度。

表2 三因素两水平正交试验设计及结果

利用Design expert7.5对实验结果进行方差分析，方差分析结果见表3。方差分析结果表明：在P<0.05的情况下，试验中三个因素对提取率的影响均为不显著。因此，选取实验中各因素水平的最优值组合，即A1B2C2，作为酶辅助提取的最佳条件。此时，测定样品中青蒿素的含量达到最大值3.34 mg。因此，纤维素酶辅助提取青蒿素的最佳工艺条件为：酶反应时间为2 h，酶添加量为0.30 g，反应温度为45℃。在此条件下，通过酶辅助提取得到青蒿素的提取率为3.34 mg/g，与未使用酶辅助提取的方法青蒿素提取率1.13 mg/g相比，优化后酶辅助提取方法中青蒿素提取率提高了1.96倍。

表3 正交试验方差分析结果

3 讨论

黄花蒿为菊科艾属一年生草本植物，在我国各地均有分布[6]。青蒿素是从黄花蒿干燥地上部分分离提取得到的一种新型化合物，其具有含过氧基团的倍半萜内酯结构，与已知抗疟药物化学结构完全不同[7]，被世界卫生组织称为“唯一有效的疟疾治疗药物”。由于青蒿素的化学合成尚未显示出商业可行性，目前商用的青蒿素主要通过植物提取[8]。工业化提取青蒿素中应用范围最广的是有机溶剂提取法，但存在提取效率低、提取率不高、溶剂消耗大和安全隐患等问题[3]。

天然产物的有效成分主要存在细胞质中，细胞壁的阻碍影响了提取率。纤维素酶是最常见的破壁酶，它可作用于天然产物纤维素为主的细胞壁，破坏细胞壁的致密结构，增加细胞内活性成分的溶出量，提高提取率[9]。纤维素酶Cellulase T4来源于绿色木霉，本实验结果表明，纤维素酶能够有效降解青蒿植物的细胞壁，增加青蒿素的提取率。不同的纤维素酶有不同的最佳反应条件，常见的影响因素有温度、pH、酶的用量、激活剂和抑制剂等[10]。本文单因素及正交实验结果表明Cellulase T4水解青蒿植物细胞壁的最佳条件为酶反应时间为2 h，酶添加量为0.30 g，反应温度为45℃，酶反应pH值4.5。在最优条件下，纤维素酶辅助提取青蒿素较未使用酶辅助的提取方法，提取率提高了1.96倍。本实验为纤维素酶在青蒿素提取方面的应用提供了理论指导，为酶技术在中药制药方面的研究和应用开拓了更为广阔的空间。

[1]赵兵，王玉春，欧阳藩.青蒿素生物合成机理研究现状[J].广西植物，1999，19（2）：154-158.

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Study of cellulose assisted extraction of Artemisinin fromArtemisia annua L.

LU Wan-yi

Department of Pharmaceutics,Guangdong Food and Drug Vocational-Technical School,Guangzhou 510663,China

ObjectiveTo study the factors affecting the yield of Artemisinin extracted fromArtemisia annuaL.by using cellulose assisted extraction.MethodsThe content of Artemisinin was determined by using UV spectrophotometric.The effects of reaction time,cellulose dose,reaction temperature,and pH value in the enzymatic reaction were studied,and then orthogonal experiments were carried out to find the optimum operating conditions.ResultsThe optimal conditions of cellulose assisted extraction were found as follows:the reaction time,cellulose dose,reaction temperature and the pH value were 2 h,0.30 g,45℃and 4.5 respectively.ConclusionThe yield of Artemisinin extracted fromArtemisia annuaL.could be improved effectively by using cellulose assisted extraction.

Artemisinin;Cellulose;Extraction

R965.1

A

1674-4721（2013）08（c）-0014-03

2013-02-26 本文编辑：魏玉坡）