苦参碱对肝癌细胞增殖及其细胞自噬的影响

范 悦 王世明 石青青

山西医科大学第一医院普通外科，山西太原 030001

在中国传统医药中，苦参碱是一种从苦参、山豆根中提取的生物碱，其分子式为C15H24N2O。而苦参碱早被广泛用于治疗病毒性肝炎、肝纤维化、心律失常等疾病[1]。国内外研究表明[2]：无论是在体内还是体外，苦参碱具有较高的抗肿瘤活性。它可以抑制肿瘤增殖、诱导分化、诱导凋亡、抗转移等作用，同时又具有免疫调节、升高白细胞、缓解癌痛等许多常规化疗药物所不具备的优势。此外，研究发现苦参碱诱导了大鼠C6胶质瘤细胞的自噬[3]。而自噬与肿瘤关系密切，同样在抑制肿瘤中起着非常重要的作用[4-5]。细胞自噬在辅助化疗药物治疗恶性肿瘤方面起着非常重要的作用。本实验通过研究不同浓度的苦参碱作用于肝癌HepG2细胞，探讨苦参碱对肝癌HepG2细胞细胞周期以及细胞自噬的影响，为临床化疗药物治疗肝癌提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

肝癌HepG2细胞由北京协和医学院提供。苦参碱（Matrine，广州白云山明兴制药有限公司）、DMEM 4.5 g/L Glu（Gibco公司）、PBS 液、胎牛血清（美国 Sigma公司）、单丹磺酞戊二胺（MDC）（美国Sigma公司）、二甲基亚砜（DMSO）、荧光显微镜（日本 OlympuS公司）、CO2培养箱、离心机（北京医用离心机厂）、流式细胞仪（美国BD公司，型号：FACSCalibur）、电热恒温培养箱 （河北省黄石市医疗器件厂）等。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及处理 将肝癌HepG2细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM培养液的培养瓶中，在37℃、5%CO2、饱和湿度下常规培养。显微镜下观察细胞贴壁达80%时，用胰酶消化处理，取对数期细胞进行实验。

1.2.2 MTT法 肝癌HepG2细胞用0.25%胰酶处理制成单细胞悬液，以每孔约104个细胞接种于96孔板（每孔100μL）。分别加入不同浓度的苦参碱溶液，使其终浓度为0.5、1.0、2.0 mg/mL，每个浓度设三个孔。然后在加培养液100 μL，每孔总体积为200 μL，同时设定空白孔及对照孔。然后放回CO2箱中培养24、36、48 h。分别在各个时间段结束前4 h加入 MTT（5 mg/mL）溶液 10 μL，反应 4 h离心弃上清液。每孔加入DMSO 150 μL振荡荡5～10 min。用酶标仪测定波长为490 nm的吸光值。根据公式计算：肿瘤细胞增值抑制率=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。

1.2.3 流式细胞术分析细胞周期 肝癌HepG2细胞以5×104/mL接种至6孔板中，细胞贴壁后，分别加入0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL的苦参碱，培养36 h后，收集细胞，并用流式细胞仪行细胞周期分析。

1.2.4 单磺酰戊二胺 （monodansylcadaverine，MDC）荧光染色 将DMEM液培养的肝癌HepG2细胞以1×104/mL接种至12孔板中，待细胞贴壁后，分别加入0.5、1.0、2.0 mg/mL的苦参碱，培养36 h弃培养液，用PBS液洗2遍，加入50 μmol/L MDC，37℃孵育10 min染色。 再用 PBS漂洗细胞3次，在荧光显微镜下观察。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 苦参碱显著抑制肝癌HepG2细胞的增殖

MTT测定结果见图1，苦参碱显著抑制肝癌HepG2细胞的增殖，并呈现时间-剂量依赖性。见表1。苦参碱0.5、1.0、2.0mg/mL作用于肝癌HepG2细胞36 h后的抑制率分别：（17.21±2.02）%、（28.25±3.20）%、（38.77±5.58）%。

表1 不同浓度苦参碱作用于肝癌HepG2细胞不同时间的抑制率（±s，%）

表1 不同浓度苦参碱作用于肝癌HepG2细胞不同时间的抑制率（±s，%）

注：同一浓度不同时间比较，P<0.05；同一时间不同浓度比较，P<0.05

浓度 24 h 36 h 48h 0.5 mg/mL 1.0 mg/mL 2.0 mg/mL 12.48±1.22 20.57±2.21 31.58±2.26 17.21±2.02 28.25±3.20 38.77±2.58 24.47±2.20 40.12±2.37 46.76±3.24

2.2 流式细胞仪检测结果

不同浓度苦参碱作用于肝癌HepG2细胞36 h后，流式细胞仪分析细胞周期见表2。结果所示：不同浓度苦参碱作用于肝癌HepG2细胞中36 h后，G1期细胞增多，S期细胞减少，呈现剂量依赖性。结果表明苦参碱将肝癌HepG2细胞阻滞在细胞周期的G1期。

表2 不同浓度的苦参碱作用于肝癌HepG2细胞36 h后细胞周期（±s）

表2 不同浓度的苦参碱作用于肝癌HepG2细胞36 h后细胞周期（±s）

注：同一时间不同浓度组之间，分别比较G1期和S期P<0.05，而G2/M期P>0.05

浓度 G1期 S期 G2/M期0.5 mg/mL 1.0 mg/mL 2.0 mg/mL 37.23±1.72 39.42±1.74 42.66±1.35 35.34±2.16 35.26±0.87 34.75±1.27 15.02±1.35 15.36±1.47 14.92±2.03

2.3 MDC染色显示苦参碱诱导肝癌HepG2细胞自噬的产生

为了研究苦参碱是否诱导了肝癌HepG2细胞自噬的产生，本文用荧光镜观察MDC染色的肝癌HepG2细胞，细胞显著的形态学变化如图2所示。MDC是自噬泡的特异性标记物荧光显微镜下观察细胞时，胞质内可见到清晰的点泡状结构，表明苦参碱诱导了自噬 的产生。

3 讨论

原发性肝癌是恶性程度最高的肿瘤之一。全球男性发病率位于恶性肿瘤的第5位，死亡率居恶性肿瘤的第2位；全球女性发病率位于第7位，死亡率位于第6位。全球每年新发肝癌约75万人，而我国占半数以上[6]。由于肝癌具有恶性程度高、病情发展快、预后差、死亡率高等特点，多数就诊时已属晚期。目前手术治疗依然是肝癌的首选，但是肝癌发病隐匿，确诊时能手术者仅占l0%～15%，因此必须联合其他非手术措施（如化疗、生物治疗等）进行综合治疗，才能有望提高肝癌患者的长期生存率[7]。近年来，苦参碱作为一种新型化疗药物，具有疗效显著、副作用小、毒性低等特点应用于临床。

苦参碱（Matrine）是中药苦参、山豆根、苦豆子的主要活性成分，具有保护肝细胞、抗病毒、抗过敏等多种药理作用[8]。此外苦参碱具有广泛的抗肿瘤作用。研究发现：在体外实验中苦参碱可明显地诱导人乳腺癌[9]、骨肉瘤[10]及肝癌细胞[11]等的凋亡。苦参碱的抗肿瘤的作用机制很多，主要包括诱导肿瘤细胞凋亡、诱导肿瘤细胞分化、诱导细胞自噬以及细胞毒等多种作用[3，12-13]。本实验结果表明：苦参碱对人肝癌HepG2细胞有明显的抑制作用，不同浓度的苦参碱作用不同时间后，肝癌细胞的存活率降低，这种抑制作用呈时间和剂量依赖性。流式细胞仪分析细胞周期结果：苦参碱作用于人肝癌HepG2细胞后，G1期细胞数目明显增多，S期细胞数目减少（P<0.05），这表明苦参碱作用肝癌细胞后将细胞周期阻滞在G1期，使细胞不能进入S期进行DNA合成，并最终抑制了肝癌HepG2细胞的抑制，本文实验结果与以往郭丹等[14]、夏宝妹等[15]、杨道科等[16]在肝癌、子宫内膜癌以及结肠癌细胞中的研究结果一致。同时荧光显微镜检测：苦参碱诱导肝癌HepG2细胞自噬泡的产生，这表明自噬参与了苦参碱抑制肝癌HepG2细胞的增殖，可能提示苦参碱作用于肝癌HepG2细胞后，自噬多发生在细胞周期的G1期。而自噬作为一把双刃剑，它与肿瘤之间的关系错综复杂，既可以促进肿瘤的生长，也可以诱导肿瘤的生长，在本实验研究中认为它参与了苦参碱抑制肝癌细胞的增殖。本文在既往研究的基础上，探讨了苦参碱对人肝癌HepG2增殖及其细胞自噬的影响，而其发生的信号通路及其作用机制仍需作进一步的研究。希望本实验研究能为细胞周期与肿瘤的增值、分化等之间的关系提供研究基础，为临床进一步更好的治疗肝癌提供理论基础。

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