四溴双酚A在鲫鱼不同器官中的分布、富集及病理研究

杨苏文,徐范范,赵明东 (中国环境科学研究院湖泊生态环境研究中心,环境基准与风险评估国家重点实验室,北京 100012)

四溴双酚 A(TBBPA)是世界范围内被广泛应用的溴代阻燃剂,主要通过塑料和电子产品的制造与加工处置和循环利用过程进入环境[1],目前已在土壤、水体、沉积物和大气等环境介质以及人体内检测到[2-8].TBBPA的水环境暴露水平日益升高,对水生生物具有潜在毒害影响.

环境污染物对水生生物的毒性效应是进行毒性效应研究及生态风险评价的基础.鲫鱼是分布于我国大部分地区的经济性鱼类,为本土物种,对TBBPA毒性效应及生态系统风险评价研究具有广泛代表性,目前已被普遍应用于生态毒理学方面的研究,但有关 TBBPA在鱼体中组织分布和富集效应的研究还较鲜见[9].因此本研究以鲫鱼(Carassius auratus)为受试生物,通过分布动力学定量地确定鱼体各组织器官中 TBBPA含量,研究TBBPA在鱼体肝脏、肾脏、鳃和肌肉中的吸收与富集效应,结合不同暴露时间鲫鱼肝脏、肾脏、鳃、性腺的组织病理学,以期初步确定TBBPA在鲫鱼体内的分布特征及作用靶器官,为阐明TBBPA的毒性效应机制机理及生态风险评价提供参考.

1 材料与方法

1.1 组织分布与生物富集实验方法

1.1.1 实验动物 鲫鱼(Carassius auratus)购于北京市通州区花鸟鱼虫市场,体长为(6.95±1.05)cm,体重为(5.90±0.80)g,在室内驯化 2 周,死亡率稳定在 1%～2%以下,试验用水为自来水,室内静置 48h 去氯,温度(25±1)℃,光周期为 14h:10h,溶液 氧 为 (7.5±0.5)mg/L,pH 值 (7.8±0.2),水 硬 度(109±10)mg/L (以 CaCO3计).

1.1.2 实验方法 TBBPA工业品(97%)为美国Alfa Aesar公司进口,采用乙醇作为助溶剂配制50mg/mL的储备液备用.将360条鲫鱼随机放入盛有60L处理液的玻璃缸内,每缸30条鱼,根据TBBPA对鲫鱼的 96h-LC50值[10]及慢性毒性实验浓度设置的一般规则[11-12],设定亚致死处理浓度为 0.5mg/L和2.0mg/L,24h更换一次相同浓度的处理液,并以助溶剂乙醇处理的鱼作对照,实验期间每天喂食1次.实验周期为32d[13].在暴露时间分别为2,4,8,16,32d取样,进行前处理后(方法参见文献[9]),HPLC测定肝脏、肾脏、鳃和肌肉中TBBPA含量,并利用公式计算生物富集系数(公式见2.2节).

1.2 组织病理切片实验方法

1.2.1 实验仪器 Thermo Shandon Excelsior组织处理机,TKY-BMB,湖北泰康医疗设备有限公司石蜡包埋机,Leica RM2235型切片机,Thermo Shandon Varistain Gemini 全自动染片机,Thermo Shandon Consul 全自动封片机,德高 Zeiss Imager. M1显微镜.

1.2.2 实验方法 暴露实验第2,4,8,16,32d每次随机取10尾鲫鱼.取鲫鱼肝脏、肾脏、鳃、精巢和卵巢组织放置于4%甲醛溶液中固定24h,固定后的组织在清水冲洗15h以上,经50%～100%各级乙醇梯度脱水,2:1、1:1、1:2的二甲苯/石蜡和全石蜡逐级渗透,最后包埋于切片用石蜡中,制成组织蜡块.将埋有组织的蜡块固定在切片机上,7µm 切片,用明胶甘油将组织薄片贴于载玻片上,37℃烘干.组织切片经二甲苯脱蜡和70%～ 100%各级乙醇梯度脱水,用苏木精染色,经过1%盐酸分化和0.1%氨水显色后,再经50%～90%各级乙醇梯度脱水,用0.5%酒精伊红(95%酒精配制)染色,95%和 100%的乙醇进一步脱水,最后用中性树胶封片.显微镜下观测并拍照,采用Photoshop软件进行图像处理和分析.观察各染毒组中甲状腺滤泡上皮厚度、细胞肥大和增生、胶质减少和滤泡上皮细胞周围血管增生等病变现象.

1.3 数据分析

数据采用origin 7.5和sigma Plot 10.0处理.

2 结果与分析

2.1 TBBPA在鲫鱼不同器官的组织分布

由图1可见,鲫鱼肝脏组织在第8d出现吸收高峰,随后下降,其中0.5mg/L暴露组32d TBBPA的浓度低于第2d的浓度,而2.0mg/L暴露组32d后的肝组织浓度为第 2d浓度的 4.1倍,达到146.61ng/g.0.5mg/L组肾脏组织在4d达到最大值,随后逐步降低,32d时浓度稍高于第 2d,为对照的4.5倍.2.0mg/L组在第8d达到最大值,32d时浓度为第2d浓度的3.4倍,为对照组的7.3倍.0.5mg/L组的肌肉组织中TBBPA含量随暴露时间延长缓慢升高,高浓度组在第8d出现吸收高峰,后快速下降,在暴露终点又显著回升,为对照组的4倍.低浓度组鳃中TBBPA随时间变化幅度较小,第32d与对照组极为接近,高浓度组第 4d时出现吸收高峰,32d时为对照组的5.2倍.

结果显示,各浓度组肝脏和肾脏 TBBPA含量都表现出先升高后下降的趋势,鳃和肌肉在0.5mg/L时TBBPA含量变化不大,高浓度时先升高后下降,肌肉在暴露后期又出现升高趋势.

2.2 TBBPA在鲫鱼不同组织器官的生物富集

根据时间(x)和TBBPA在鲫鱼不同组织器官的浓度(y)拟合得到式(1),符合毒代动力学一级吸收模型,根据所得方程得到各个参数见表1,TBBPA暴露实验中各器官组织富集系数(a)随暴露时间的变化见图2.

式中:y为TBBPA在鲫鱼不同组织器官的浓度;x为暴露时间;拟合公式后得到参数a,b,x0,其中,a为各器官组织富集系数;x0为相应变化时间.

结果显示,各器官富集系数随暴露时间的延长先升高再逐渐减小.在实验浓度下肝脏富集系数相近,最大富集系数为 395,均落在 10～11d之间;0.5mg/LTBBPA组鲫鱼肾脏的最大富集系数为 945,2.0mg/L组肾脏的富集系数远小于0.5mg/L处理组,表明鲫鱼肾脏功能可能受损不能执行正常的排泄和解毒机能.2.0mg/L组鲫鱼鳃的富集系数显著高于 0.5mg/L组,最大富集系数为72,时间为10.26d,肌肉富集系数变化不大.

图1 TBBPA在鲫鱼不同器官的组织分布Fig.1 Tissue distribution of TBBPA in Carassius auratus

表1 鲫鱼各器官的富集系数及参数Table 1 Bioaccumulation factor and the parameters in

2.3 TBBPA暴露对鲫鱼器官组织的组织病理变化

对照组肝组织切片(图3A)的肝细胞呈多角型,细胞核大而圆,核仁居中,胞质染色深,细胞膜界限清晰.暴露后2d,肝细胞轻微肿胀,胞质淡染,部分细胞空泡化,单位面积内肝细胞数量减少.暴露后 4～8d,肝细胞肿胀严重,肝细胞索状结构破坏,肝细胞弥散.暴露后 16d,肝细胞索状结构消失,部分细胞的胞膜破裂、溶解,胞浆基质变淡,胞核高度浓缩,有的甚至核仁都不可见,发现色素沉积物.暴露后32d(图3B),肝细胞肿胀扩展到整个肝,细胞基质大量丢失,胞核固缩(坏死),高浓度组中发现大量色素沉积物,经普鲁士蓝染色证实为含铁血黄素沉积物.实验中暴露TBBPA后,鲫鱼肝脏表现出时间-剂量依赖性的病理损伤,具体分析见表 2,说明肝脏可能是TBBPA作用的靶器官.

对照组肾组织切片(图 3C)的正常肾小体为一圆囊结构,肾小球是一团毛细血管,肾小囊包在肾小球外面,两层之间为肾小囊腔.暴露后 2～4d,肾小管中有弥散的色素沉积,部分肾小球毛细血管明显萎缩,甚至坏死,并在肾小管上皮细胞内发现少量色素沉积物.暴露后 8～16d,肾小球毛细血管明显萎缩,肾小囊腔变宽,肾小球及其附近区域发现大片的色素沉积物,肾小管上皮细胞中色素沉积增多.暴露后32d(图3D),肾小球囊内大片的色素沉积,可能为坏死的肾小球毛细血管球残骸,经普鲁士蓝染色证明是含铁血黄素.暴露TBBPA后肾脏的病变呈时间依赖性增长,具体分析见表3,主要表现为肾小球毛细血管萎缩、坏死,肾小囊腔变宽,肾小球及肾小管上皮细胞内色素沉积增多,但两剂量组之间差异不显著.

图2 长期暴露后TBBPA在鲫鱼不同器官组织的生物富集系数(BCF)变化Fig.2 Bioconcentration factor (BCF) of TBBPA in different tissues of Carassius auratus after longterm exposure

对照组鳃丝切片(图 3E)结构完整清晰,鳃小片排列整齐有序.暴露后 2～4d,鳃切片中观察到鳃小片上皮细胞轻度增生,部分还伴有鳃小片细胞的脱落,使邻近鳃小片相互粘连.暴露后 8～6d,鳃小片上皮细胞增生加剧,部分鳃小片扭曲、细胞脱落.暴露后 32d(图 3F),在两剂量组均可观察到鳃小片大量融合.

表2 鲫鱼肝组织结构随暴露时间变化Table 2 Liver structure changes of Carassius auratus with time in chronic exposure test

表3 鲫鱼肾组织结构随暴露时间变化Table 3 Kidney structure changes of Carassius auratus with time in chronic exposure test

图3 鲫鱼TBBPA暴露的器官组织病理观察Fig.3 Observation of histopathology exposured TBBPA in Carassius auratus

对照组精巢切片(图 3G)可见排列整齐完整的精小叶,精小叶腔内充满大量的精子细胞,核圆形,较致密,聚集在一起形成大的团块.暴露后 2～4d,精小叶排列混乱,基膜局部溶解,间质细胞增多.暴露后8～16d,精小叶基膜部分溶解,小叶间质进一步扩大.暴露后 32d(图 3H),精小叶基膜相互溶解,精子聚集在一起形成大的团块,基膜外间质细胞局部增多.

对照组和两剂量组卵巢切片观察(图3I,J),卵母细胞呈圆形、椭圆形或多角形,细胞质嗜碱性,核浅蓝色,位于细胞中央.核仁沿核膜内缘分布.经对比发现,对照组与处理组未见异常现象.

3 讨论

肝脏是生物体最主要的物质代谢场所和解毒器官,污染物易造成肝脏的脂肪化和细胞扩增等组织损伤[14],还可造成线粒体囊泡化和细胞核损伤等超微结构的变化[15].组织学研究表明,TBBPA能引起孕期小鼠的肝脏损伤[16].本研究结果表明,TBBPA暴露对肝脏表现为时间-剂量依赖性关系,同时病理切片显示,鲫鱼肝细胞空泡变性,细胞核膜破裂、核仁溶解消失,部分肝细胞坏死,表明 TBBPA蓄积对肝脏具有较强毒害作用[17-19].陈玛丽等[20]发现 TBBPA 低剂量(0.025,0.25mg/L)暴露12周能够引起红鲫肝脏脂肪化、空泡化和线粒体囊泡化等现象,而高剂量暴露还导致肝脏细胞核损伤和细胞间隙增大等现象,造成红鲫肝脏的损伤.这可能与污染物通过引起肝脏的物质代谢紊乱[20],或者通过诱导活性氧的产生导致肝脏细胞代谢增强, 进而引起肝脏中物质代谢紊乱[21-24]有关.

肾脏是鱼体最重要的毒物排泄器官,肾功能受损时,以肾脏作为主要去除途径的毒物消除速度减慢,可产生蓄积和病变,排泄 TBBPA 机能受损,导致血液 TBBPA含量升高使血流不丰富的肌肉组织也出现 TBBPA的积累现象.Schauer等[25]在研究小鼠一次口服300mg TBBPA/kg bw的代谢动力学时发现,TBBPA在小鼠体内的代谢半衰期为13h,由于TBBPA与谷胱甘肽等生物转化酶或发生硫化反应使其生物利用性降低,TBBPA对机体的损害是通过与受体或酶的结合进行的.而 kang等[26]研究发现小鼠完全排泄TBBPA需要2d,TBBPA不会在体内积累,对肾脏没有损伤.本研究表明低浓度 TBBPA暴露鲫鱼肝脏和肾脏可正常代谢,高浓度组则代谢受阻.这可能与 TBBPA随血液进入肾脏后,自由基对细胞中的各种酶造成损伤,使鱼类机体抗氧化系统损伤所致[27-28],产生蓄积和病变,排泄机能受损有关.

本研究中鲫鱼精巢的病理损伤严重,精小叶基膜破裂,这可能导致小叶内部环境的紊乱,激素营养物质的平衡受到破坏,不利于精子的成熟和发育,这一结论与陈玛丽[29]的研究结果一致,而本研究同时发现,在相同 TBBPA浓度暴露下鲫鱼卵巢组织未发现病理损伤,表明 TBBPA暴露下鲫鱼精巢比卵巢更易受到毒害威胁.在对鲫鱼鳃切片的的观察表明,鳃小片上皮细胞大面积增生、融合会严重影响鳃的正常气体交换,这必然影响鳃的呼吸、分泌和排泄功能,这些与在试验过程中观察到的实验组的鱼经常将嘴露出水面或鳃盖煽动速度加快的缺氧现象相吻合.

4 结论

4.1 组织分布动力学的研究表明,肝脏和肾脏是 TBBPA含量最高的部位,具有较强生物富集能力. 在暴露10～11d时,肝脏和肾脏富集能力最强,最大富集系数分别达到395和945.鳃和肌肉的富集能力较低.

4.2 不同浓度 TBBPA暴露后,鲫鱼肝脏、肾脏和鳃均表现出时间-剂量依赖性的病理损伤,低浓度肝组织切片未见明显病变; 肾脏有弥散性沉积;鳃小片上皮细胞轻度增生,部分伴有鳃小片细胞的脱落,后期有融合现象.高浓度肝细胞肿胀严重,肝细胞索状结构破坏,肝细胞弥散,细胞基质大量丢失,胞核固缩;肾小球毛细血管明显萎缩,甚至坏死;鳃小片上皮细胞的大面积增生,致使数条鳃小片融合在一起.

4.3 在相同暴露浓度下,雄鱼的性腺损伤程度高于雌鱼.精巢在2.0mg/L TBBPA暴露下病理损伤严重,卵巢未发现明显病变.

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