腹腔镜手术对子宫内膜癌细胞转移潜能影响的实验研究

黄守国，秦 杰，陈 瑾，程 虹，蒙 秋，张 静，王海燕

子宫内膜癌是女性生殖道最常见的恶性肿瘤之一，占女性生殖道恶性肿瘤的20% ～30%。手术治疗的目的在于切除癌变组织及癌细胞可能转移或已转移的病灶，并同时进行全面的手术病理分期。传统的子宫内膜癌手术方法对患者创伤较大，术后恢复慢。随着腹腔镜仪器的完善及器械的革新，腹腔镜微创手术治疗子宫内膜癌，效果更好［1－3］。本研究对子宫内膜癌腹腔镜手术、开腹手术及腹腔镜下全子宫切除术后子宫内膜标本手术前后的细胞凋亡率、肿瘤转移促进基因MTA1和转移抑制基因nm23－H1表达水平进行了对比研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料 选择我院2009年9月—2011年12月子宫病变 (子宫内膜癌Ⅰ期及子宫良性病变)患者60例，根据患者病情及选择的手术方法分为3组。子宫内膜癌Ⅰ期要求行腹腔镜手术者20例进入腹腔镜手术组:年龄47～73岁，平均(59.2±7.2)岁。子宫内膜癌Ⅰ期患者要求行开腹手术者20例进入开腹手术组:年龄48～70岁，平均 (58.8±6.9)岁。子宫良性病变无生育需求，要求行腹腔镜下全子宫切除术者20例进入空白对照组:年龄49～69岁，平均 (57.7±6.3)岁。患者术前均未进行化疗、放疗、生物治疗等其他治疗，排除其他系统合并症及系统肿瘤等。

1.2 主要仪器与试剂 流式细胞仪:美国BD公司生产，荧光PCR仪:BIO－RAD公司，型号:MJ OPTICON2(美国)，Taq酶:货号DR001A(TaKaRa，日本)，ReverTra Ace－a－反转录试剂盒:货号FSK－100(TOYOBO，日本)，PCR扩增引物:MTA1、nm23－H1及β－actin的mRNA，设计引物探针所用软件为Primer express 2.0软件，由上海英骏生物技术有限公司合成，常规的化学试剂为国产分析纯。

1.3 实验方法

1.3.1 标本采集 3组患者标本均在术前0.5 h(排除患者本身日常生活及手术准备影响)内采取子宫内膜组织，术后即刻 (保证离体子宫内膜组织的细胞凋亡率及基因表达未受其他因素影响)取子宫内膜组织，并置于－80℃冰箱待测。

1.3.2 流式细胞仪测定细胞凋亡率

1.3.2.1 单细胞悬液的制备 取受检组织0.5～1.0 g，置于重叠的100目铜网及300目尼龙网上，切成1 mm×1 mm×1 mm碎块，以眼科镊持碎块在网上揉搓，边搓边用磷酸缓冲液(PBS)将搓下的细胞冲洗液置于网下方的平面皿中，直至将组织搓完，收集细胞悬液于10 ml离心管中，以800 r/min离心5 min，以2 ml PBS液漂洗，再以1 500 r/min离心5 min，弃上清液，调整细胞数为106/ml，4℃保存。

1.3.2.2 细胞凋亡率的检测 将细胞溶液吸人5 ml试管中，1 500 r/min离心5 min，以PBS液漂洗后再离心，PBS液漂洗后以100目筛网过滤，1 500 r/min再离心5 min，加入PI工作液0.5 ml(工作浓度为10 μg/ml)，室温避光反应30 min。用流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期。检测前以标准荧光微球调整仪器的变异系数并稳定在2%以内，上机收集2×104个细胞，荧光强度以对数放大，光散射数据存软盘，测试完毕后用Modifit软件 (BD公司提供)分析数据。分析时用设门方法(横坐标前向角，纵坐标侧向角)将坏死细胞框除，计算细胞凋亡率。细胞凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.3.3 实时荧光定量RT－PCR检测MTA1、nm23－H1基因表达水平

1.3.3.1 引物探针 基因序列如下

1.3.3.2 引物探针/基因序列 (1)H β－actin forward/5'GGA TGC AGA AGG AGA TCA CTG 3';(2)H β－actin probe/FAM－CAG GAG GAG CAA TGA TCT TGA TCT TCATTGTGCBHQ1; (3)H β－actin reverse/5'CGA TCC ACA CGG AGT ACT TG 3'; (4)H MTA1 forward/5'CCT ACC TGC CCA TCA ACA GCG C3';(5)h MTA1 probe/FAM－CCA TCA AGG CCG AGTGCACGGCGC－BHQ1;(6)HMTA1reverse/5'TCAGCA CCA GCG GGC TCT G3';(7)H nm23－H1forward/5'TTT GAG CAG AAA GGA TTC C3';(8)h nm23－H1 probe/FAM－TGT TGG TCT GAA ATT CAT GCA AGC TTC C－BHQ1;(9)h nm23－H1 reverse/5'AAC GTA GTG TTC CTT GAG3'。

1.3.3.3 人子宫内膜 (癌)组织总RNA的提取 (1)从超低温冰箱中取出人子宫内膜 (癌)组织样本，迅速用剪刀剪下约0.25 g样品，置于预先加入200 μl RNAisoTMPlus的1.5 ml EP管中。 (2)在RNAisoTMPlus溶液中破碎人子宫内膜(癌)组织，补充800 μl RNAisoTMPlus，混匀。在冰上静置5 min，再加入200 μl氯仿，盖紧后剧烈振荡15 s(氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开)。待溶液充分乳化后，在冰上静置5 min。(3)4℃，13 000 r/min高速离心样品15 min后，将上层水相移至新管中，然后加入等体积的异丙醇，冰上放置10 min，4℃，13 000 r/min离心10 min。(4)弃上清，用1 ml 75%乙醇〔焦碳酸二乙酯 (DEPC)水配制〕洗涤沉淀，来回颠倒数次，4℃，13 000 r/min离心5 min。(5)弃上清，空气干燥RNA 10 min，用20 μl DEPC水溶解，立即取2 μl RNA做反转录，剩余18 μl－80℃冻存。

1.3.3.4 逆转录反应 抽提的总RNA进行反转录:取2 μl RNA模板做逆转录反应，反应体系如下:RNA的热变性，先配好以下体系:25 μmol/L 随机引物 (random primer)1 μl，DEPC 水 9 μl，RNA 2 μl，总共12 μl。65 ℃ 水浴5 min 后迅速在冰上冷却2 min，简短离心收集反应液。反应液配置 (20 μl体系) 第一步变性后的 RNA 溶液 12 μl，5×RT buffer 4 μl，dNTP mixture(各 10 mmol)2 μl，RNase Inhibitor(10 U/μl)1 μl，Rever Tra Ace 1 μl;RT 反应程序:30 ℃ 10 min，42 ℃20 min，99℃ 5 min，4℃ 5 min。

1.3.3.5 荧光定量PCR反应 配制反应体系共25 μl:10 PCR buffer 2.5 μl，2.5 mmol dNTP 2 μl，dH2O 16 μl，15 μmol/L 引物 1+1 μl，15 μmol/L 探针 0.3 μl，5 U/μl Taq 0.2 μl，Template 2 μl，PCR buffer成分:100 mmol Tris－ HCl缓冲液 (pH=8.3)，500 mmol KCl，15 mmol MgCl2;反应过程:94℃ 2min，94℃ 5 s，55℃，30 s，40个循环，读取羧基荧光素 (FAM)荧光数值;30℃ 5 s。样本同一个检测指标基因统一上机，每个标本分别做2个待检测基因以及内参β肌动蛋白 (β－actin)的荧光定量PCR。

1.4 统计学方法 应用SPSS 19.0统计软件进行分析，计量资料细胞凋亡率及基因表达量均采取配对样本的t检验，以P＜0.001为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 平均细胞凋亡率 腹腔镜手术组术后子宫内膜癌平均细胞凋亡率较术前增高，差异有统计学意义 (P＜0.001);开腹手术组和空白对照组手术前后子宫内膜癌平均细胞凋亡率无明显变化，差异无统计学意义 (P＞0.001，见表1)。

2.2 MTA1基因表达量 腹腔镜手术组术后子宫内膜癌组织MTA1基因表达量较术前降低，差异有统计学意义 (P＜0.001);开腹手术组和空白对照组手术前后MTA1基因表达量无明显变化，差异无统计学意义 (P＞0.001，见表1)。

2.3 nm23－H1基因表达量 腹腔镜手术组术后子宫内膜癌组织nm23－H1基因表达量较术前增高，差异有统计学意义(P＜0.001);开腹手术组和空白对照组手术前后nm23－H1基因表达量无明显变化，差异无统计学意义 (P＞0.001，见表1)。

表1 3组标本手术前后细胞凋亡率、MTA1基因及nm23－H1基因表达量的比较Table 1 Comparison of specimens cell apoptosis rate，MTA1 gene and nm23－H1 gene expression amount before and after surgery in three groups

3 讨论

肿瘤的发生源于细胞的异常增殖，表现为自主性生长的生物学行为。正常情况下，细胞的增殖与凋亡维持组织中细胞总数的动态平衡，一旦细胞的增殖异常或细胞凋亡发生异常，均可导致细胞的恶性转化，发生肿瘤。随着研究工作的不断深入，越来越多的资料表明，细胞凋亡异常在肿瘤的发生发展过程中占有重要位置。随着细胞凋亡研究在医学、生物学各个领域的不断深入，发现细胞凋亡的诱导因素多种多样。同一种组织和细胞受到不同因素的诱导，其凋亡的结果不尽相同，而一种诱导因素对不同的组织和细胞诱导凋亡的结果也不尽相同。细胞凋亡受体内、体外多种因素的影响，如系统信息、离子辐射及病毒感染等引起的细胞损伤、释放细胞生长因子、细胞之间的相互作用以及激素释放水平的变化，均影响细胞凋亡［4－5］。

本研究发现，在腹腔镜手术机体环境改变时，子宫内膜癌细胞凋亡率由术前的 (3.55±0.60)%升高至术后的 (25.23±2.16)%，差异有显著性;空白对照组正常子宫内膜细胞的凋亡情况手术前后无明显变化;开腹手术对子宫内膜癌细胞的凋亡率亦未见明显影响。这说明腹腔镜手术时机体环境的改变作为一种诱因只影响子宫内膜癌细胞的凋亡状态，且是一种升调节，而对正常子宫内膜细胞的凋亡情况没有影响。同时本研究还表明子宫内膜癌细胞的凋亡情况不受开腹手术刺激的影响，可见腹腔镜手术刺激作用有助于子宫内膜癌细胞的凋亡。

MTA1基因是从大鼠乳腺癌细胞系13762NF细胞中分离发现的，MTA1基因以共价修饰组蛋白、编码转录因子、参与信号传导途径、调节有关基因的表达等方式，调节细胞的生长，影响肿瘤细胞的转移。在MTA1过度表达的肿瘤一般均表现为深的浆膜层肿瘤浸润度、高的淋巴结肿瘤转移率和显著的血管肿瘤侵袭性［6］。nm23基因是从K－1735鼠黑色素瘤细胞株中用消减杂交法分离出来的一种与恶性肿瘤转移有关的基因，即肿瘤转移抑制基因。人类nm23基因cNDA有两个亚型即nm23－H1、nm23－H2。发生淋巴转移的恶性肿瘤与未发生淋巴转移者相比，nm23－H1的表达水平明显降低，未发生淋巴转移的恶性肿瘤患者的nm23－H1表达阳性率明显高于发生淋巴转移者［7］。

本研究发现，子宫内膜癌腹腔镜术前转移促进基因MTA1的表达水平明显高于术后，转移抑制基因nm23－H1的表达水平明显低于腹腔镜术后，两者差异均有显著性;子宫内膜癌开腹手术组及空白对照组正常子宫内膜组织中MTA1、nm23－H1基因表达量无明显差异;子宫内膜癌腹腔镜术后转移促进基因MTA1表达量明显低于子宫内膜癌开腹术后，而转移抑制基因nm23－H1表达量明显高于子宫内膜癌开腹术后。这说明在腹腔镜手术时，机体腹腔内环境的改变对子宫内膜癌组织MTA1基因的表达呈降调节，nm23－H1基因的表达成升调节，通过影响细胞转移参与调节子宫内膜癌细胞的转移潜能，而开腹手术对MTA1、nm23－H1基因的表达无明显影响，同时说明正常子宫内膜组织中以上两基因的表达水平不受腹腔镜手术环境改变的影响。

综上，本实验研究发现:腹腔镜手术后子宫内膜癌细胞的凋亡率明显上升，其机制可能与机体受腹腔镜气腹刺激，内环境动态失衡有关，并且可能通过升调节nm23基因的表达和降调节MTA1基因的表达，从而抑制其转移潜能。而腹腔镜手术对子宫内膜细胞凋亡率无影响，且不影响其nm23、MTA1基因的表达，这可能与机体细胞所处的功能状态有关。从而可以得出腹腔镜手术用于治疗子宫内膜癌具有抑制其细胞的增殖和转移能力的作用，是一种安全的手术方法。

1 Taylor SE，McBee WC Jr，Richard SD，et al.Radical hysterectomy for early stage cervical cancer:laparoscopy versus laparotomy ［J］.JSLS，2011，15(2):213 －217.

2 Maestri D，Reis RJ，Bacha OM，et al.A comparison of radical vaginal hysterectomy combined with extraperitoneal or laparoscopic pelvic lymphadenectomy in the treatment of cervical cancer［J］.Int J Gynecol Cancer，2011，9.［Epub ahead of print］.

3 Salicrú S，Gil－ Moreno A，Montero A，et al.Laparoscopic radical hysterectomy with pelvic lymphadenectomy in early invasive cervical cancer［J］.J Minim Invasive Gynecol，2011，18(5):555 －568.

6 Rao Y，Wang H，Fan L，et al.Silencing MTA1 by RNAi reverses adhesion，migration and invasiveness of cervical cancer cells(SiHa)via altered expression of p53，and E－cadherin/β －catenin complex［J］.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2011，31(1):1 －9.

7 Wang QX，Wang TX，Liu WX.Expression of ERK and nm23－H1 in tongue squamous cell carcinoma and its relation with invasion and metastasis［J］.Shanghai Kou Qiang Yi Xue，2011，20(3):269－272.