Notch信号通路相关基因在儿童急性髓系白血病中的表达及意义

张建华，杨成胜，岳绍中，可秋萍，娄 莹

(新乡市中心医院，河南 新乡 453000)

急性髓系白血病(AML)是儿童造血组织的恶性增殖性疾病，白细胞在生长、分化和发育的一定阶段发生恶性变，使其丧失正常的功能，导致恶性克隆性病变无节制的增殖，全身器官、组织广泛浸润，破坏其正常的结构和功能，最终导致机体器官衰竭。近年来，随着化疗、造血干细胞移植和支持疗法的不断改进，儿童白血病的临床疗效大为改善，但鉴于儿童白血病在免疫学分型、治疗上与成人有较大的差别，其对治愈率及其预后均提出更高的要求。2010年5月～2011年9月，我们检测了Notch信号通路中相关分子 Notch1、Notch2、Jagged1、Jagged2、Delta4在儿童AML中的表达情况，探讨了Notch信号通路相关分子在儿童AML发病中的作用，为白血病的靶向治疗提供实验依据。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择我院初诊的AML患儿20例(AML组)，男13例、女7例，年龄2～13岁、中位年龄7.8岁。同期选择我院完全缓解的AML患儿20例(对照组)，男10例、女10例，年龄1～13岁、中位年龄6.5岁。两组均经骨髓细胞形态学、免疫分型、染色体核型分析、融合基因检查确诊，符合中华医学会儿科学分会血液学组制定的诊断标准［1］。两组性别、年龄具有可比性，

1.2 检测方法 ①提取单个核细胞:无菌条件下抽取患儿新鲜骨髓5 mL，EDTA抗凝;移至离心管中，每1 mL加入5 mL红细胞裂解液，混匀后静置冰上3 min，4℃ 750 r/min离心3 min;弃上清液加2 mL红细胞裂解液，混匀后至冰上1 min，4℃ 750 r/min离心3 min;弃上清液加1 mL Trizol液，用移液器吹打使红细胞充分裂解，常温静置5 min，置于－80℃保存，用于RNA制备。②RNA的提取及纯度和浓度的测定:用Trizol试剂提取细胞总 RNA;提取4 μL RNA，加入DEPC液至1 mL，在用DEPC水校正过的紫外分光光度仪上进行测定。在波长为260 nm和280 nm处分别有2个读数OD260值和OD280值，通过两者的比值(OD260值/OD280值)计算RNA的纯度。总RNA样品含量的计算:在260 nm波长的紫外线下，1 OD=40 μg/mL RNA。RNA样品浓度(μg/μL)=OD260值 × 核酸稀释的倍数 ×40/1000。样本总 RNA OD260值/OD280值的比值范围在1.8～2.0。如果比值太小，说明样品中残存的蛋白质或者其他杂质含量较多，则需要重新应用酚/氯仿提取。③cDNA链的合成:逆转录反应体系20 μL，包括总 RNA 2 μL，Oligo(dT)181 μL，DEPC 水 9 μL，混匀后65℃ 5 min，冰浴1 min后加入5×reaction buffer 4 μL，RNasin 1 μL，100 mmol/L dNTP mix 2 μL，M-MulV 逆转录酶 1 μL，混匀 42 ℃逆转录 60 min，70℃加热5 min，产物于－20℃保存。④实时定量RT-PCR反应体系:以β-actin为内参，取cDNA 5 μL，分别加入 Template 1 μL，Primer11 μL，Primer21 μL，2 × SYBR Green Master 12.5 μL，加 ddH2O补足至总体积25 μL。反应条件:94℃变性5 min;94℃ 30 s，58℃ 1 min，循环30次;72℃延伸10 min。取 PCR 产物5 μL+6 × loading buffer 1 μL 混匀，加入1.5%琼脂糖凝胶的加样孔中，应用罗氏Lightcycler2.0定量分析仪进行 PCR扩增反应。Notch信号通路中各基因引物及探针序列见表1。

表1 Notch信号通路中各基因引物及探针序列

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件，计量资料以表示，结果比较采用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

AML组和对照组受体Notch1、配体Jagged2、配体Delta4表达水平比较均有统计学意义(P均＜0.01)，受体 Notch2、配体 Jagged1表达水平比较均无统计学意义(P均＞0.05)。见表2。

3 讨论

目前在哺乳动物中共发现4个同源Notch受体和5个同源配体，其中同源受体是Notch1～4，分别定位于染色体 9q34.3、lp13 ～ p11、19p13.2 ～ p13.1和6p21.3;同源配体有2类，即Delta样配体和Serrate样配体，前者包括 Delta1、Delta3、Delta4，后者包括Jagged1和Jagged2。Notch信号传导通路由Notch受体蛋白、Notch配体蛋白、CSL(DNA结合蛋白)、靶分子组成。在Notch信号转导过程中，Notch受体与配体结合，通过γ分泌酶复合物介导的酶切活化将Notch受体从细胞膜释放入胞内区，后者是可溶性的Notch活化形式(ICN)，ICN转移至细胞核并与CSL DNA结合蛋白相互作用，形成转化活化因子，进而调节基因表达。目前Notch基因在成人急性白血病发病机制中的作用研究较多，并且在临床上已经成为一个合理的分子靶向治疗位点，但鉴于儿童白血病在分型、治疗、预后等方面与成人有较大差别，是否适用于儿童还有待进一步研究。

表2 两组Notch信号通路相关基因的表达比较()

表2 两组Notch信号通路相关基因的表达比较()

注:与对照组比较，*P ＜0.01

组别 n 受体Notch1 Notch2配体Jagged1 Jagged2 Delta4 AML 组 20 9651.2 ±821.5* 307.5 ±174.2 4803.5 ±3553.8 5291.2 ±102.3* 16749.3 ±382.7*对照组 20 327.1 ±135.7 250.3 ±186.2 5311.9 ±3880.5 143.7 ± 25.3 803.5 ±183.2

研究显示，在AML患者中存在有核磷酸蛋白基因的突变，尤其在正常核型的AML是最常见的分子遗传学异常，具有重要的临床意义［2］。Tohda等发现，AML患者可高度表达 Notch1蛋白;Palomero等［3］发现，在AML患儿体内存在激活的Notch1基因突变，AML初诊患者及AML完全缓解患者HES1表达水平均高于正常对照组。提示在AML体内存在Notch信号通路的异常活化，且AML完全缓解患者HES1表达水平高于AML初诊患者。Kogoshi等［4］提出，GSI可使敏感的AML中 HES1 mRNA明显升高。以上均提示，在AML的发病过程中，Notch信号通路通过其他信号转导通路发挥作用。Yan等［5］发现，Notch信号通路相关基因可能与AML的耐药性有关。最近应用荧光素酶检测法研究表明，在AML有11号染色体倒置和骨髓增生异常综合征患者中存在MLL基因和MAML2基因融合，从而影响 Notch 的活化［6］。

本研究发现，Notch1、Notch2、Jagged1、Jagged2、Delta4在正常骨髓单个核细胞中都有表达，提示Notch信号通路分子广泛表达于骨髓，调节正常造血;而AML组骨髓中受体Notch1和配体Jagged2、Delta4的表达水平明显高于对照组，受体Notch2、配体Jagged1的表达在两组之间无统计学差异，提示在儿童AML的发病过程中，白血病细胞在分子水平上发生了改变，使得 Notch信号分子异常表达，Notch信号通路中各个分子之间通过相互联系和作用，并且与其他信号通路形成交互通话，造成调节Notch信号转导的网络失衡，进而可能导致AML的发生、发展。研究表明，在儿童AML中，Notch信号通路中分子的表达水平并不一致，提示可能存在不同的致癌信号途径或其他未发现的相关因素参与调控，使细胞所在的微环境或Notch受体、配体等相关分子量及活性发生改变，最终导致细胞增殖、分化及细胞周期抑制、凋亡等不同结果［7］。

综上所述，在儿童AML中存在Notch信号通路的异常表达，为揭示儿童AML的发病机制提供了新的理论依据，并为儿童白血病的分子靶向治疗开辟了新的途径。

［1］中华医学会儿科学分会血液学组，中华儿科杂志编辑委员会.儿童急性淋巴细胞白血病诊疗建议(第三次修订草案)［J］.中华儿科杂志，2006，44(5):392-395.

［2］颜灵芝，陈苏宁，梁建英，等.急性髓系白血病患者NPM1基因突变分析［J］.中华血液学杂志，2007，28(5):289-293.

［3］Palomero T，McKenna K，O-Neil J，et al.Activating mutations in NOTCH1 inacute myeloid leukemia and lineage switch leukemias［J］.Leukemia，2006，20(11):1963-1966.

［4］Kogoshi H，Sato T，Koyama T，et al.Gamma-secretase inhibitors suppress the growth of leukemia and lymphoma cells［J］.Oncol Rep，2007，18(1):77-80.

［5］Yan S，Ma D，Ji M，et al.Expression profile of Notch-related genes in multidrug resistant K562/A02 cells compared with parental K562 cells［J］.Int Lab Hematol，2009，32(2):150-158.

［6］Nemoto N，Suzukawa K，Shimizu S，et al.Identification of a novel fusion gene MLL-MAML2 insecondary acute myelogenous leukemia and myelodysplastic syndrome with inv(11)(q21q23)［J］.Genes Chromosomes Cancer，2007，46(9):813-819.

［7］Tohda S.Functional analysis of notch in the pathophysiology of leukemia［J］.Rinsho Byori，2009，57(4):351-356.