乌梅丸对TNBS诱导的溃疡性结肠炎大鼠脾脏组织β-arrestin1表达的影响

柯琴梅，吴 霁，范 恒

(1 华中科技大学同济医学院附属协和医院，武汉 430022;2 南昌大学第三附属医院)

目前认为，免疫等因素在结肠炎的发病机制中起重要作用。正常情况下，机体一方面通过诱导T细胞活化增殖去除抗原，另一方面通过T细胞凋亡而抑制T细胞过度产生和活化，从而使肠黏膜内免疫系统处于一种适合机体生存的平衡状态。若T细胞凋亡受抑，体内T细胞将过度活化与增殖，并分泌炎性因子［1］，导致肠道炎症发生。研究表明，乌梅丸治疗溃疡性结肠炎有显著疗效［2，3］。范恒等［4，5］研究表明，乌梅丸可下调结肠组织 β2AR、βarrestin2、NF-κB p65 的表达，减少肠道炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10 释放，减轻肠道炎症损伤。2010年9月～2011年9月，我们观察了乌梅丸对2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的结肠炎大鼠脾脏组织β-arrestin1 mRNA和蛋白表达的影响，旨在研究乌梅丸治疗结肠炎的免疫机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 56只清洁级健康雄性(SD)大鼠56只，体质量200～250 g，由华中科技大学同济医学院动物中心提供，均在湿度为50% ～70%、温度为20℃的动物房内饲养。随机分成空白对照组、模型组、美沙拉嗪组、乌梅丸组各14只。

1.2 实验试剂 5%TNBS购于美国Sigma公司。Trizol购于Invitrogen公司;RNA提取试剂盒DP430，cDNA第一链合成试剂盒KR104-02，RNase抑制剂DP418购于天根;引物合成于金斯瑞;SYBR Green PCR Master Mix(2X)#K0242，实时荧光定量PCR仪ABI7500，引物由 Primer6.0软件设计。RIPA裂解液(强)、BCA蛋白浓度测定试剂盒，聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，相关一抗、二抗，ECL底物液;电泳槽、电转仪Millipore。乌梅丸，按传统方法配制成含生药质量浓度分别为0.515 g/L的水煎剂;将88片美沙拉嗪(0.5 g/片)用研钵研细，100目筛过筛，研磨，配成50 kg/L混悬液。

1.3 实验方法

1.3.1 模型制备及干预 除空白对照组外，其他组大鼠均在禁食、不禁饮24 h后给予TNBS灌肠。具体方法:用10%的水合氯醛以3 mL/kg腹腔注射麻醉，将导尿管缓缓插入大鼠肛门8 cm，先后缓慢注入50%乙醇溶液0.25 mL、5%的 TNBS溶液0.3 mL，将大鼠提尾倒置30 s，待清醒后自由饮食、进水。模型建成后，观察各组大鼠精神状态、大便颜色及形状、皮毛等变化。2 d后，美沙拉嗪组每天予美沙拉嗪混悬液3 mL灌胃，乌梅丸组每天用等量乌梅丸药液灌胃，空白对照组和模型组每天用等量蒸馏水灌胃，连续15 d。每组大鼠死亡4只，因此每组实验大鼠最后各剩10只。第16天每只大鼠禁食、不禁水24 h后处死，取大鼠脾脏，并各分为2份，装于EP管中，用液氮冰冻保存。

1.3.2 β-arrestin1 mRNA表达检测 采用 RT-PCR法。按RNA提取试剂盒DP430的方法提取脾脏组织RNA，用分光光度计测量浓度，取5 μL模板RNA、Oligo(dT)15(10 μmol/L)2 μL、ddH2O(Rnase free)6 μL混匀后放入PCR仪中，70℃ 5 min，立即置于冰上1 min，瞬时离心并加入以下试剂:5×RT buffer 4 μL、HRP(RRI)/RNase Inhibitor 0.5 μL、M-MLV 0.5 μL、dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，总体积为 20 μL的反应体系。逆转录条件:42℃ 30 min，99℃5 min，4 ℃ 5 min。 β-arrestin1 引 物:5'-CT CAAGCATGAGGACACGAA-3'，5'-TTAGGCTTGGGGT GCATTAG-3'。扩增条件:95℃ 60 s预变性，进入PCR 循环95℃ 15 s，58℃ 15 s，72℃ 45 s，40个循环，以β-actin为内参，对β-arrestin1的产物相对定量，读取CT值，使用2-ΔΔCT方法进行相对定量分析。

1.3.3 β-arrestin1蛋白表达检测 采用 Western blot法。取250～500 mg脾脏组织，剪碎加1 mL RIPA裂解液(强)，匀浆抽提总蛋白，并按BCA蛋白质定量试剂盒说明操作，测定蛋白浓度。取70 μg总蛋白上样电泳，用12%的PAGE凝胶电泳。取出凝胶根据Marker切下目的条带，用蒸馏水冲洗，剪与PAGE凝胶相同大小的PVDF膜和滤纸，PVDF膜用甲醇浸泡数秒后和滤纸一同浸泡于电转缓冲液中。转膜条件:200 mA，120 min。用含5%脱脂奶粉的TBST(封闭液)浸泡PVDF膜，室温摇床封闭2 h。一抗:用封闭液1∶700 稀释 β-arrestin1、1∶1000 稀释GAPDH相应的一抗。使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育过夜。TBST充分洗涤PVDF膜5～6次，每次5 min，封闭液1∶10000稀释羊抗兔二抗，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，室温摇床孵育2 h。显色曝光:TBST充分洗涤PVDF膜5～6次。结果采用光密度扫描灰度值分析。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以表示，多组间两两比较采用SNK-q检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠组织病理改变 模型组固有层和黏膜层内可见弥漫性中性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞浸润，结肠黏膜腺体排列紊乱，杯状细胞减少。空白对照组黏膜和固有层结构完整，腺体排列较整齐。乌梅丸组和美沙拉嗪组淋巴细胞等炎性细胞浸润较模型组减轻，黏膜及固有层结构相对完整，杯状细胞较模型组多，腺体排列相对整齐。

2.2 脾脏组织β-arrestin1 mRNA、蛋白的表达 见表1。

3 讨论

溃疡性结肠炎是一种慢性非特异性肠道炎症性疾病，其病因和发病机制仍不清楚。目前，大多数研究认为其发病机制主要由免疫反应介导，是与遗传、感染、环境因素等密切相关的慢性炎性疾病，且细胞因子在溃疡性结肠炎的发病中起着重要的作用。βarrestin1在机体广泛表达，可存在于细胞质和细胞核，作为脚手架蛋白与连接分子(比如磷脂类和β-衔接蛋白)连接参与多种信号通路，在抗凋亡通路中起重要作用。廖奕等［6］研究表明，氧化苦参碱可下调结肠组织 β-arrestin1表达，抑制 δ阿片受体(DOR)-β-arrestin1-Bcl-2信号转导通路，治疗TNBS诱导的实验性大鼠结肠炎。

表1 四组脾脏组织β-arrestin1 mRNA、蛋白的表达比较()

表1 四组脾脏组织β-arrestin1 mRNA、蛋白的表达比较()

注:与空白对照组比较，△P ＜0.05;与模型组比较，#P ＜0.05

组别 β-arrestin1 mRNA β-arrestin1蛋白乌梅丸组 1.54 ±0.14# 0.74 ±0.19#美沙拉嗪组 1.63 ±0.27# 0.77 ±0.15#模型组 3.27±0.41△ 1.50±0.15△空白对照组1.05 ±0.06 0.62 ±0.07

乌梅丸由乌梅、细辛、干姜、黄连、当归、附子、蜀椒、桂枝、党参、黄柏组成。乌梅丸出自仲景《伤寒论·厥阴病篇》，方中以乌梅酸敛收固，附子、干姜、桂枝扶阳以胜寒，蜀椒、细辛通阳以破阴，附子、干姜、蜀椒、桂枝、细辛，辛热以助其阳，温以祛寒;黄连、黄柏之苦寒以坚其阴，清以泻热，党参、当归益气养血，诸药合用，使寒热邪去，阴阳协调，气血恢复。全方酸收熄风，辛热助阳，酸苦坚阴，寒热温凉，温清敛补，攻补兼施，诸药配伍，调理阴阳寒热虚实，使之归复于平和。本研究发现，乌梅丸组与美沙拉嗪组均较模型组结肠黏膜及固有层结构相对完整，腺体排列相对整齐，杯状细胞多，炎性细胞浸润较模型组减轻，表明乌梅丸与美沙拉嗪对溃疡性结肠炎有较好的治疗作用。本研究还发现，模型组β-arrestin1 mRNA、蛋白表达较空白对照组升高，乌梅丸组及美沙拉嗪组β-arrestin1 mRNA、蛋白表达较模型组降低。提示乌梅丸可通过下调β-arrestin1表达发挥治疗结肠炎的作用。可能机制:①通过DOR-β-arrestin1-Bcl-2信号转导途径介导T细胞的抗凋亡作用。研究表明，T细胞的TCR/CD28共刺激信号被激活后，使细胞质内β-arrestin募集至TCR上，使cAMP水平降低，下调cAMP-PKA-Csk抑制性信号，完全活化T细胞，继而激活 TrkA/IP3/Akt/NF-κB信号通路，诱导T细胞表达DOR［7］。活化的 DOR信号能诱导CD4+T细胞胞质内β-arrestin1转移至细胞核内，进入细胞核内的β-arrestin1募集组蛋白乙酰化酶p300至Bcl-2启动子位点结合，使Bcl-2的启动子序列区域组蛋白H4乙酰化作用增强，导致Bcl-2基因转录，促进抗凋亡蛋白Bcl-2表达［8］，从而抑制T细胞凋亡。②此外，β-arrestin1还可通过磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt信号通路介导抗凋亡作用［2］。乌梅丸可下调脾脏组织β-arrestin1的mRNA和蛋白表达，继而通过多个信号转导途径［9］促进脾脏组织T细胞的凋亡、减少T细胞分泌炎症因子，从而减轻结肠黏膜的炎症反应。因此，以CD4+T细胞为靶向，研制相关的单克隆抗体或者其他药物降低CD4+T的数目和反应性，可望为治疗结肠炎提供更好的方法。

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