国产硫酸黏菌素中B2组分的分离和结构解析

尹大全 袁晖 黄君勤

（上海新亚药业有限公司 上海 201203）

硫酸黏菌素，又名硫酸抗敌素或多黏菌素E硫酸盐，是一种由多种氨基酸和脂肪酸所组成的碱性多肽类抗生素。其作用原理是与细胞膜黏附，改变细胞膜的结构使之通透性变强，细胞因吸收周围环境过多的水分而膨胀死亡。由于其具有肾毒性和神经毒性，在过去的几十年内临床上使用较少。而近几年里，随着“超级耐药菌”，临床治疗面临严重威胁，老的抗菌药物硫酸黏菌素和多黏菌素B被再次启用，作为治疗泛耐药性革兰阴性杆菌感染的最后选择[1]。

多黏菌素是从多黏杆菌发酵培养液中分离纯化获得的多肽类抗生素，由于不同菌种所产生的多黏菌素所含氨基酸不同，共有A、B、C、D、E五种多黏菌素，除C外，每一种均包含两个主要组分，各种多黏菌素的差别只是在3，6和7位上的氨基酸残基和氨基末端的脂肪酸不同。由于结构相似，各种多黏菌素抗菌谱相似，对几乎所有革兰阴性杆菌均有杀菌作用，其中以多黏菌素B和E毒性最小、疗效最高[2]。

本研究采用欧洲药典7.0版中硫酸黏菌素[3]有关物质测定方法，对本公司生产的硫酸黏菌素与欧洲药典标准品所含有效组分进行了对比研究，并通过制备液相对不同的组分进行了分离纯化和结构鉴定，为产品的质量控制提供依据。

1 仪器与试药

Agilent 1100高效液相色谱仪，Phenomenex Gemini C18液 相 色 谱 柱（4.6 mm×150 mm, 5 µm）；Waters 2767/2545型制备液相色谱仪，Phenomenex Luna C18制备色谱柱（21.2 mm×250 mm, 5 µm）；Varian 500兆核磁共振仪；液质联用LC（Agilent）-MS（API150EX）。

乙腈（色谱纯，Fisher）；无水硫酸钠（分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司）；硫酸黏菌素标准品（EP，批号：002UO2）；硫酸黏菌素（上海新亚药业有限公司，批号：1205301，1205302，1205303）。其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 多黏菌素E组分对比

根据EP7.0版中硫酸黏菌素质量标准所述，硫酸黏菌素中含有5种有效组分，分别为多黏菌素E1、E2、E3、E1-I、E1-7MOA（图1）。取本公司产品及EP标准品，分别照质量标准中有关物质方法测定，结果显示本公司三批样品与EP标准品除保留时间约为15.7 min增加了一个色谱峰外，其他组分基本一致（图2）。

图1 硫酸黏菌素结构图

图2 硫酸黏菌素组分HPLC色谱图

2.2 目标组分的分离纯化

取硫酸黏菌素样品（批号：1205301，50 g），经高压制备液相分离，分别收集不同保留时间段的流份，经C18柱脱盐，TFA水洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥，得到保留时间为15.7 min的目标组分。该物质为白色粉末，易溶于甲醇和水，HPLC测得其纯度在98%以上（图3）。

2.3 目标组分的化学结构确证

2.3.1 核磁共振（1H-NMR，13C-NMR）

测试单位：中科院上海药物研究所。

测定条件：D2O为溶剂，TMS为内标，室温（23℃）。测定数据和解析如下（表1）。

表1 碳谱数据、氢谱数据和多键碳氢关系解析

（续表1）

1H-NMR显示7.0～7.5 ppm可见有5个芳质子，提示有一取代的苯环。δ0.5-1.2 ppm显示有6个甲基峰，且为d峰，提示有-CH(CH3)2。δ4.05-4.42 ppm区域显示有12个次甲基峰，符合硫酸黏菌素化学结构中环肽的10个氨基酸连接位(-NH-CH-CO-)上的-CH，同时还提示有2个苏氨酸中的-CH(OH)CH3。结合H-HCOSY,ROESY谱对上述氢谱中的质子进行了归属，与文献[4-5]报道多黏菌素B2的化学结构一致。

13C-NMR中显示有关物质中有55个碳，DEPT谱显示有12个季碳，19个CH，18个CH2，6个CH3，其中19个CH根据化学位移结合1H-NMR、HMQC和HMBC可分别归属为氨基酸连接位上的C有10个，芳环上有5个CH，及2个末端甲基上CH，2个苏氨酸上-CH(OH)-CH3。

12个季碳中11个为羰基上的碳，1个为苯丙氨酸中苯环上的碳；18个-CH2中12个为L-Dab氨基酸，4个为6-MHA上的-CH2，1个为D-Phe上的CH2，1个为L-Leu上的-CH2；6个甲基碳分别为FA上的2个末端甲基，亮氨酸上的2个末端甲基，2个苏氨酸上的末端甲基。

13C-NMR谱中，各C的归属及与相应H的相关关系、远程相关关系均作了解析，具体归属及数据见表1。

通过1H-NMR、13C-NMR、DEPT、1H-1H COSY、HMQC和HMBC谱，基本确证了目标组分的化学结构与文献报道的多黏菌素B2一致。

2.3.2 质谱（LC-MS）

测试单位：中科院上海药物研究所。测定数据和解析如下。

高分辨质谱显示（m/z）（M+H）+，1189.7411，分子式为C55H97N16O13，理论计算值为1189.7416，误差为0.05。ESI-MS谱显示准分子离子峰(m/z)为1190，[M+2H]2+为596，[M+Na]为1212，MS/MS显示1172为脱去H2O的离子（M+H-18）。963(1190-227)，863(963-100)，762(863-101)和662(762-100)，以上显示氨基酸的裂解规律，与文献报道的多黏菌素B2一致，质谱裂解途径见图4。

图4 多黏菌素B2 ESI/MS/MS质谱裂解途径

综上所述，通过NMR和MS谱的解析，高分辨质谱给出的分子量及分子式均与文献报道的多黏菌素B2一致，故本公司硫酸黏菌素中分离纯化获得的组分鉴定为已知的多黏菌素B2（图5）。

图5 多黏菌素B2的结构

3 讨论

硫酸黏菌素是由多黏芽孢杆菌经发酵产生的一种碱性高分子多肽化合物，其组分较为复杂，不同的菌种、培养条件和分离纯化方法都可能导致其组分有一定的差别。EP硫酸黏菌素标准品中有效成分为E1、E2、E3、E1-I和E1-7MOA，其中E1和E2为主要成分；实验研究表明，我公司产品的组分除上述成分外，还包含有B2。目前我公司将此组分作为杂质来控制，限度为3.0%，但该组分同样也是多黏菌素B中有效抗菌活性成分之一，其原料和注射剂在中国药典、欧洲药典和美国药典中均有收载。

致谢

特别感谢上海美迪西生物医药有限公司的蔡金娜博士对以上图谱解析工作提供的技术帮助。

[1] 李然, 王睿, 李碧艳. 多粘菌素对泛耐药革兰阴性杆菌严重感染临床应用新进展[J]. 中国药物应用与检测, 2009,6(6): 364-367.

[2] 俞文和, 杨纪根. 抗生素工艺学[M]. 沈阳：辽宁科学技术出版社, 1988: 333-336.

[3] European Pharmacopoeia Commission. European Pharmacopoeia 7.0[EB/OL]. [2013-05-28]. http://db.yaozh.com/foreign/EP7.0/0320E.pdf

[4] Orwa JA, Govaerts C, Busson R, et al. Isolation and structural characterization of polymyxin B components[J]. J Chromatogr A, 2001, 912(2): 369-373.

[5] Orwa JA, Govaerts C, Busson R, et al. Isolation and structural characterization of colistin components[J]. J Antibiot, 2001,54(7): 595-599.