采用改进的溶血试验法考察低渗静脉注射液的安全性

山广志，任连杰，李群，张彤，陈思，余立#（1.中国医学科学院医药生物技术研究所，北京100050；.北京市药品检验所，北京 100035）

静脉输液的安全性问题历来都为药品研发、生产、使用与监管部门所密切关注，而静脉输液的渗透压及其导致的溶血情况与产品安全性密切相关。近年来，国内药学工作者利用冰点降低法对临床使用的多种注射剂品种进行了渗透压摩尔浓度考察[1-3]，有力地促进了国内注射剂的质量提升。

由于冰点降低法测得的数据主要反映注射剂中晶体物质产生的渗透压，因此，单一地采用冰点降低法对低渗注射液进行考察，往往忽略了药物对血细胞的保护作用以及胶体溶液产生的胶体渗透压等作用。为了掌握低渗注射液对血液细胞的真实影响程度，有必要进一步联用溶血试验对静脉注射液进行安全性考察。

本文以2010年版《中国药典》一部（中药）[4]和二部（化学药）[5]附录中收载的“溶血与凝聚检查法”为基础进行了方法改进，采用供试品溶液直接进行试验，消除了稀释溶剂（生理盐水，即0.9%氯化钠溶液）对样本渗透压的影响；采用分光光度计进行检测，提高了方法的客观性和准确性。通对对国内外5个企业共3种规格8个批号的人血白蛋白样品的体外溶血情况进行了考察，结果表明建立的方法能够客观反映注射液渗透压对血细胞的影响，可为该类药品的开发研究、药品标准的科学制订以及临床医师制订给药方案提供一定的参考。

1 材料

1.1 仪器

UV-2401PC紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；SMC30B渗透压摩尔浓度测定仪（天和医疗仪器有限公司）；纯水机（美国Poll公司）；微量移液器（北京吉尔森科技有限公司）。

1.2 试剂

校正用标准氯化钠溶液（以下简称校正溶液，天津天河医疗仪器有限公司，批号：080703、080704，渗透压摩尔浓度：100、500mOsmol/kg）；0.9%氯化钠溶液（自制，称取氯化钠4.5g加水溶解并稀释至500ml，渗透压摩尔浓度：289mOsmol/kg）。

1.3 样品

市售品人血白蛋白[国内A企业，批号：200810082、200811088，规格：10%（5g∶50ml）；国内 B 企业，批号：20081227、20081228，规格：20%（10g∶50ml）；国内C企业，批号：20090102，规格：20%（10g∶50ml）；国外D企业，批号：TBAB7BJ001，规格：20%（10g∶50ml）；国内E企业，批号：20081126、20081128，规格：20%（5g∶25ml）]；氯化钠为优级纯。

新鲜兔血，来自北京维通利华实验动物技术有限公司的日本大耳白家兔，♂，18周龄，体质量2.3kg，合格证号：SCXK（京）2010-0002。

2 方法与结果

2.1 渗透压摩尔浓度的测定

以超纯水调节仪器零点，分别用100、500mOsmol/kg校正溶液进行仪器校正。

取50µl供试品置于干燥洁净测试管中，按照2010年版《中国药典》三部（生物制品）附录收载的渗透压摩尔浓度测定法项下要求进行测定[6]。不同生产厂家的人血白蛋白注射液的渗透压摩尔浓度见表1，表明除国外D企业生产的产品外其余产品均为低渗注射液。

表1 8批样品渗透压摩尔浓度及溶血率测定结果Tab 1 Results of osmolarity and hemolytic rate of 8batches of samples

2.2 低渗注射液溶血试验

2.2.1 兔血红细胞悬液的制备。取新鲜兔血约20ml，置于锥形瓶中，加入两粒玻璃珠，室温下置于摇床中振摇15min。加入0.9%氯化钠溶液约50ml，振摇，弃去纤维蛋白，以3000r/min的速率离心5min，弃去上清液，用0.9%氯化钠溶液洗涤沉渣，继续以3000r/min的速率离心5min，直至上清液无色透明。小心移去上清液，用移液管取下层红细胞5ml，加0.9%氯化钠溶液至50ml，翻转混匀。按表2中的阳性对照管方法制备并测定兔血红细胞悬液在576nm波长处的吸光度（A），调整红细胞悬液浓度，使A576nm在0.8～1.4之间。

2.2.2 溶血率的测定方法。由于试验采用可见光波长检测，考虑到各注射液颜色之间的差异，试验除了制备阴性对照管、阳性对照管和供试品试验管以外，还设置了供试品本底对照管，以消除注射液颜色对测定结果的影响。

按照表2分别加入相应溶液制备成各试验管，混匀。

表2 各试验管的制备Tab 2 Preparation of each test tube

将各管置于（37±0.5）℃水浴30min；取出后冰浴10min，分别测定576nm波长处的吸光度。溶血率按照下式进行计算：溶血率＝（A供试品试验管－A供试品本底对照管－A阴性对照管）/（A阳性对照管－A阴性对照管）×100%。

2.3 精密度试验

精密量取0.9%氯化钠溶液15ml，置于50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，以得到的0.27%的氯化钠溶液（渗透压摩尔浓度为85mOsmol/kg）作为供试品溶液，照“2.2.2”项下方法，平行测定6份。结果溶血率分别为93.33%、93.52%、94.54%、94.09%、92.13%、91.33%，平均值为93.16%，RSD＝1.30%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.4 重复性试验

分别取批号为200810082的人血白蛋白注射液6份，照“2.2.2”项下方法测定，结果溶血率分别为48.96%、50.23%、48.57%、48.06%、49.36%、47.66%，平均值为48.80%，RSD＝1.88%（n＝6），表明方法重复性良好。

2.5 低渗注射液溶血率考察结果

取不同生产厂家的人血白蛋白样品按照“2.2.2”项下方法进行测定，结果见表1。

表1结果显示，渗透压摩尔浓度低于200mOsmol/kg的低渗人血白蛋白制品均存在不同程度的溶血。当人血白蛋白渗透压摩尔浓度在191mOsmol/kg时，溶血率约为12%；当渗透压摩尔浓度降至154mOsmol/kg时，溶血率迅速升至约30%。

各厂家不同规格的人血白蛋白渗透压摩尔浓度与溶血率之间的相关性并不完全一致，且不具有白蛋白剂量相关性。如：E厂家2批产品（20%规格）的渗透压摩尔浓度约为110mOsmol/kg，溶血率约为60%；A厂家2批产品（10%规格）的渗透压摩尔浓度约为70mOsmol/kg，而溶血率约为50%。说明不同厂家采用不同生产工艺和处方对溶血率亦有不同影响，同时说明单一利用冰点降低法考察摩尔渗透压浓度并不能完全反映注射液由于低渗导致的溶血状况。

3 讨论

《中国药典》（二部）（化学药）自2000年版开始就收载了冰点降低法进行渗透压摩尔浓度的测定，并要求静脉输液应尽可能与血液等渗，且应在标签上注明溶液的渗透压摩尔浓度[7]。2010年版的《中国药典》（一部）（中药）和三部（生物制品）也增订了渗透压摩尔浓度测定法。但冰点降低法测定的摩尔渗透压浓度主要反映稀溶液的晶体渗透压[8]，对复杂组分注射液尤其是具有胶体性质的注射液采用溶血法测定其溶血率，较单纯采用冰点降低法进行渗透压考察结果更加客观。

2010年版《中国药典》中收载的“溶血与凝聚检查法”[4-5]主要适用于考察药品本身所具有的溶血特性。试验过程中采用0.9%氯化钠溶液稀释供试品溶液，不适用于由注射液低渗导致的溶血情况的考察；且结果判断采用人工目视，对于有色供试品的结果判断存在一定困难。本文对《中国药典》方法进行了改进，采用供试品溶液直接进行试验，消除了稀释溶剂对样本渗透压的影响；并采用分光光度法对试验结果进行检测，提高了方法的客观性和准确性。

方法建立过程中采用阳性对照管溶液在200～800nm波长范围内进行光谱扫描，在可见光区的最大吸收波长为576nm；而供试品本底对照管溶液在可见光区无明显吸收，且A576nm＜0.05，故本法选择576nm作为检测波长。

人血白蛋白属于胶体溶液，可维持70%～80%血浆有效胶体渗透压[9]。笔者曾采用冰点降低法对国内外人血白蛋白产品的渗透压进行考察，结果显示当时的国内市场上国产人血白蛋白渗透压摩尔浓度在100～200mOsmol/kg范围内，大多属于低渗注射液[3]。2010年版《中国药典》（三部）在人血白蛋白质量标准中首次增加了渗透压摩尔浓度检查项[6]。本试验结果证实：《中国药典》将人血白蛋白渗透压摩尔浓度规定在210～400mOsmol/kg范围内，能够有效防止低渗人血白蛋白对使用者造成的影响（本文采用的试验样品为2010年版《中国药典》实施前收集的市售产品）。

利用溶血试验进一步考察低渗注射液的临床安全性是对仅凭冰点降低法检查渗透压、间接研究注射液对血红细胞影响的有效补充，可以更直接准确地反映制剂对血细胞的影响。建议研发静脉输液品种时除了采用冰点降低法进行渗透压考察外，还应进行溶血情况考察；临床进行静脉注射液配伍使用和给药方式研究时，也建议关注输注药液的渗透压摩尔浓度情况，并进行溶血试验考察，防止由于输注低渗注射液导致体液渗透压改变而影响患者耐受性甚至导致安全性问题的出现。

[1] 李娅萍，杨敏智，张斗胜，等.2009年国产加替沙星注射剂评价性抽验结果及质量评价[J].药物分析杂志，2011，31（3）：484.

[2] 王波，李斌，孙吉令.六种静脉输液品种渗透压摩尔浓度考察结果分析[J].中国药品标准，2010，11（5）：351.

[3] 山广志，纪宏，余立，等.国内外人血白蛋白产品的渗透压现状调研[J].中国新药杂志，2009，18（16）：1490.

[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：附录92-93.

[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：二部[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：附录116.

[6] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：三部[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：212-213、附录30-31.

[7] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：二部[S].2000年版.北京：化学工业出版社，2000：附录71.

[8] 屠锡德，张均寿，朱家壁.药剂学[M].3版.北京：人民卫生出版社，2002：586-588.

[9] 段红杰，柴家科，邓虎平.人血白蛋白的功能及其在危重病治疗中的应用[J].解放军医学杂志，2012，37（10）：926.