无患子皂苷对大鼠实验性心肌缺血再灌注损伤的保护作用

卞 海， 居 靖， 王雅娟， 杨 帆， 陈 明， 龙子江*

(1.安徽中医学院，安徽合肥 230038;2.安庆市立医院，安徽安庆 246003;3.安徽省中医院，安徽合肥 230038)

无患子Sapindus mukurossiGaerth.别名皮皂子、肥皂树、洗手果，为无患子科无患子属落叶乔木［1］，其植物的果皮、茎及果实中含有三萜类化合物、皂苷、脂肪酸及黄酮类化合物。其中的皂苷类成分无患子皂苷是一种天然的非离子型表面活性剂，具有多种生物活性［2-3］。前期研究发现无患子皂苷能有效改善实验大鼠左心室血流动力学，增强心肌收缩力，说明无患子皂苷具有改善心脏血流的功能。本课题主要就无患子皂苷是否具有减轻再灌注损伤的作用进行探索。

1 实验材料

实验动物:雄性SD大鼠，体质量200～250 g，许可证号:SCXK(苏)2008-0004，由南京医科大学动物中心提供;阳性药物:复方丹参片 (北京医药集团合肥神鹿双鹤药业有限责任公司提供，批号:20100810);实验药物:无患子皂苷，纯度为92.4%(合肥新新助剂公司提供，批号20111218);试剂:琥珀酸脱氢酶 (SDH)、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒 (均由南京建成生物工程研究所提供，批号20111020);主要仪器:HX—300动物呼吸机 (成都泰盟科技有限公司)，XD—7100单道心电图机 (上海医用电子仪器厂)，754紫外-可见分光光度计 (上海精密科学仪器有限公司生产)。

2 实验方法

2.1 动物模型制备 大鼠随机分为假手术组 (等容量蒸馏水)、模型组 (等容量蒸馏水)、复方丹参片组 (0.052 g/kg)，根据前期实验的剂量设计［4］将无患子皂苷组分为无患子皂苷大剂量组 (0.486 g/kg)、无患子皂苷小剂量组(0.054 g/kg)。适应性饲养1周后，各组大鼠分别按照相应剂量灌胃给药，每天1次，连续7 d。实验方法［4］略做改进，末次药后20 min，以戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，将大鼠仰位固定于手术台上，作颈正中切口，分离气管并行气管内插管，连接小型动物呼吸机 (动物呼吸机设定潮气量为18，呼吸频率为58次/min，吸呼比为2∶1)。经左上肢、右上肢、左下肢和右下肢皮下插入心电图引导电极，实施Ⅱ导联心电图监测。左胸部消毒剪毛后自左侧3～4肋间开胸，小心剪开心包膜，暴露心脏，以6-0无损伤缝合线于肺动脉圆锥及左心耳间迅速结扎冠脉左前降支，打活结，闭胸。各组动物在结扎30 min后迅速打开结扎线进行再灌注180 min。假手术组仅开胸，穿线不结扎，其余操作同模型组。

2.2 指标检测及方法

2.2.1 监测心电图 筛选出正常心电图的大鼠，监测并分别记录各鼠手术前、结扎即刻，再灌注即刻及再灌注后60 min、120 min、180 min的标准Ⅱ导联心电图，用游标卡尺测量 S-T 段升高值［5］。

2.2.2 血清酶学和心肌梗死面积 再灌注180 min后，腹主动脉取血6 mL后3 000 r/min离心10 min，分别测定LDH、SDH的水平;剖取心脏并立即用冰生理盐水冲洗去除心脏残血，用滤纸吸干心脏，电子天平称定质量后进行TTC染色，按照试剂盒要求操作可发现，因脱氢酶还原TTC而缺血危险区变为红色，因脱氢酶消失而梗死区变为白色，将梗死区和非梗死区用刀片切割分离，梗死范围以梗死区占缺血区质量的百分比表示。

3 实验结果

3.1 无患子皂苷对心电图S-T段的影响 与假手术组大鼠比较，模型组在缺血及再灌注即刻时心电图S-T段显著抬高，提示造模成功 (P＜0.01);与模型组比较，大剂量组大鼠的心电图S-T段下降较为明显 (P＜0.01)，其余各药物组均有明显下降趋势，说明无患子皂苷能有效减轻模型大鼠S-T段的抬高，详见表1。

表1 无患子皂苷对心肌缺血再灌注模型大鼠心电图S-T段的影响 (ΔS-T，mv)(±s，n=10)

表1 无患子皂苷对心肌缺血再灌注模型大鼠心电图S-T段的影响 (ΔS-T，mv)(±s，n=10)

注:与假手术组相比，##P＜0.01;与模型组相比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

组别 缺血再灌注5 min 30 min 5 min 60 min 120 min 160 min假手术组 －0.03±0.01 0.02±0.01 0.02±0.01 0.03±0.01 0.03±0.01 0.04±0.01模型组 －0.38±0.10## 0.38±0.12## 0.38±0.15## 0.36±0.10## 0.36±0.15## 0.31±0.14##无患子皂苷小剂量组 0.30±0.11 0.22±0.03* 0.20±0.10 0.25±0.08* 0.22±0.08* 0.21±0.08*无患子皂苷大剂量组 0.19±0.07* 0.17±0.05* 0.12±0.07＊＊ 0.16±0.04＊＊ 0.15±0.07＊＊ 0.14±0.10＊＊复方丹参片组 0.20±0.05* 0.19±0.08* 0.17±0.04＊＊ 0.22±0.03* 0.21±0.07* 0.15±0.03＊＊

3.2 无患子皂苷对血清酶释放的影响 术后再灌注180 min，模型组大鼠血清中SDH水平较假手术组明显降低(P＜0.01)，LDH的水平显著高于假手术组 (P＜0.01);与模型组比较，无患子皂苷能明显升高大鼠血清中SDH的水平，并显著降低LDH的水平 (P＜0.05，P＜0.01)，结果见表2。

3.3 无患子皂苷对心肌梗死范围的影响 再灌注180 min后，解剖取得大鼠心脏并进行TTC染色，模型组心肌梗死区面积较大且梗死严重，与假手术组比较有显著性差异 (P＜0.01)，说明复制动物模型成功;无患子皂苷各剂量组与模型组相比较，均能使大鼠的心肌梗死范围减少，其中无患子皂苷大剂量组效果显著 (P＜0.01)，说明无患子皂苷能有效降低模型大鼠心肌的梗死率，结果见图1。

表2 无患子皂苷对心肌缺血再灌注模型大鼠SDH和LDH的影响 (±s，n=10)

表2 无患子皂苷对心肌缺血再灌注模型大鼠SDH和LDH的影响 (±s，n=10)

注:与假手术组相比，##P＜0.01;与模型组相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

组别 SDH/(U·mg－1prot)LDH/(U·mg－1prot)假手术组181.2±3.6 6 583.2±325.6模型组 165.4±2.3## 8 569.4±218.7##无患子皂苷小剂量组 171.9±4.2* 7 893.6±256.3*无患子皂苷大剂量组 179.4±5.7＊＊ 6 952.7±385.6＊＊复方丹参片组 173.5±4.9* 7 290.1±299.5＊＊

4 讨论

图1 无患子皂苷给药后对心肌缺血再灌注模型大鼠心肌梗死率的影响 (±s，n=10)

冠状动脉结扎法主要通过狭窄或闭塞冠状动脉造成心肌缺血或梗塞，最大的优点为临床相关性好［6］。缺血导致心肌损害，而再灌注就象双刃剑，通过改善心肌氧供和限制心肌细胞“自溶”来减少梗死面积，同时引起心脏局部细胞因子网络的失衡及某些细胞因子、黏附分子的过度表达［7］，在一定程度上加重了再灌注的损伤。本实验通过制备大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，观察无患子皂苷对其心电图S-T段、血清酶学以及心肌梗死范围的作用。结果显示，无患子皂苷各剂量组模型大鼠的心电图S-T段呈明显的下降，并能显著降低LDH和升高SDH的活性，减少心肌梗死率的发生 (P＜0.01)。

实验研究发现，心肌缺血再灌注时，心肌产生大量的氧自由基，由于氧自由基可转化成羟氧自由基作用于细胞膜，损害心肌细胞膜的结构和功能，导致细胞内大量的乳酸脱氢酶 (LDH)释放，加剧了心肌缺血再灌注的损伤［8］。LDH是参与各组织糖酵解过程中主要的酶，代表着机体无氧代谢能力的高低，是无氧氧化的标志酶［9］，对心肌能量代谢有重要的影响。SDH为有氧代谢-三羧酸循环的限速酶和线粒体的标志酶，主要分布于线粒体内膜，其活性可反映三羧酸循环的强弱［10］。心肌缺血再灌注时，LDH的异常可引起无氧酵解能力代偿性的提高，导致LDH释放进一步增强，SDH活性下降，而心肌能量代谢发生异常;心肌受损后，细胞膜结构易被破坏而导致心肌酶大量释放入血，相关心肌酶释放量均异常。现代研究表明，心肌缺血缺氧，心肌组织严重损伤时，LDH水平明显增加，其升高程度与心肌梗死程度相平行［11］，当SDH活性下降，能量代谢平衡被破坏，则引起心肌收缩紊乱［12］，引发心肌损伤。本实验室前期的研究发现，无患子皂苷能够改善实验性大鼠心肌缺血的症状，能够降低心肌缺血是发生的过氧化水平［4］，改善心肌缺血再灌注损伤时的心肌酶学指标及白介素、TNF-α、NF-κB 等炎性因子水平［13-14］，并能够降低原发性高血压及肾性高血压大鼠的血压并改善高血压大鼠的血管活性物质，保护损伤血管［15-16］，而本实验也发现，无患子皂苷各剂量组与模型组相比，S-T段抬高趋势和心肌梗死面积均有所减少，并可显著升高SDH和降低LDH的活性，表明无患子皂苷对心肌缺血再灌注损伤起到一定的保护作用，而高血压时心、脑、肾靶器官的损伤是其致死的主要原因，尤其是心脏这一血液循环的关键部位，这保护心脏这一重要靶器官也是高血压治疗、提高患者生活质量的关键。西药治疗在降压方面有较好的效果，但其对于靶器官则没有直接的保护作用，如果将中西医合用，则能够在降压的同时，保护重要脏器，明显提高患者的生活质量。无患子皂苷既能降低实验性高血压大鼠的血压，又对心脏有一定的保护作用，并能够改善大鼠心肌缺血和缺血再灌注损伤。

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