应用PC12细胞损伤模型筛选中药活性成分的研究进展

嵇源源， 楚小晶， 王剑文

(苏州大学药学院，江苏苏州 215123)

PC12细胞是大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤分化的细胞株，是一种儿茶酚胺细胞，能合成贮存并释放适量的儿茶酚胺 (主要是多巴胺和去甲肾上腺素)，具有典型的神经细胞特征，常用于神经细胞死亡方式和神经毒性损害研究［1］。PC12细胞曾经用于抗神经系统退行性疾病的药物如雷帕霉素、L-肌肽等的开发［2-3］。目前，有关PC12细胞应用于天然药物的神经损伤保护机制的研究报道也日渐增多［4-5］，在具有神经保护作用的天然药物筛选中，PC12细胞模型已逐渐得到广泛应用。但尚未见PC12细胞体外损伤模型建立方法以及利用该模型进行中药活性成分筛选的文献综述。本文将系统介绍PC12细胞建立的体外模型、方法和具有保护活性的中药活性成分，为神经系统退行性疾病天然药物开发研究提供依据和参考。

1 PC12建立的体外模型

PC12细胞表面存在大量的神经生长因子受体，神经生长因子可诱导PC12细胞分化成交感神经元样细胞，从而在形态生理生化及功能方面更接近于神经元，是体外研究神经细胞分化及信号转导机制的主要模型［6］。未分化的PC12可看作未成熟的神经元，建立体外模型时通常采用未分化的PC12细胞。

1.1 帕金森病的细胞损伤模型 许多神经毒素如6-羟基多巴胺 (6-hydroxydopamine)，1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶 (MPTP)，农药杀虫剂鱼藤酮、百枯草等在体内可以引起帕金森病，病理机制包括氧化应激、抑制线粒体氧化呼吸链、神经元的凋亡等。应用上述神经毒素损伤PC12细胞，建立帕金森模型可进行帕金森病理观察和细胞生物化学变化等方面的测定。

1.1.1 MPP+损伤模型 MPTP是一种神经毒素，在脑内可转化为MPP+，最终导致多巴胺能神经元变性、死亡。选用MPP+(200～600 μmol/L)分别作用PC12细胞12～48 h，最佳建模条件为500 μmol/L MPP+损伤细胞24 h，细胞存活率为56%［7］。活性天然产物红景天苷［7］、芍药苷［8］等对其损伤具有保护作用。

1.1.2 百草枯损伤模型 百草枯是一种除草剂，结构类似于MPP+，也可用来建立帕金森模型。以百草枯 (200～1 000 μmol/L)分别损伤PC12细胞12～48 h建立体外模型，24 h细胞活力为49.11% ～81.12%，最佳造模条件为800 μmol/L百草枯损伤PC12细胞24 h［9-10］。表没食子儿茶素没食子酸酯［10］及五味子乙素［11］等对该模型都具有保护作用。

1.1.3 6-羟基多巴胺损伤模型 6-羟基多巴胺神经毒素能选择性作用于儿茶酚胺能神经元，是多巴胺能神经细胞的毒剂。采用6-羟基多巴胺损伤PC12细胞建立模型，具有时间浓度依赖性，PC12细胞经过250 μmol/L 6-羟基多巴胺24 h和36 h的损伤后细胞存活率为63%和45%，选用250 μmol/L，24 h为最佳造模条件［12］。谷精草提取物［13］、表没食子儿茶素没食子酸酯［14］等对该模型具有保护功能。

1.1.4 鱼藤酮损伤模型 鱼藤酮是从醉鱼豆属植物毛鱼藤Derris ellipticaBenth的根、叶中分离出的主要化学成分，可透过细胞膜存在于线粒体，抑制线粒体呼吸链复合物I，发挥细胞毒作用［15］。鱼藤酮常用于建立帕金森的细胞模型［16］，对PC12细胞的损伤具有浓度依赖性 (0.5～1.0 mmol/L)，细胞的存活率从 76.01% 降低到 58.87%［17］。槲皮素［18］、Bu-7［19］等活性天然产物具有保护作用。

1.2 阿尔兹海默病模型

β-淀粉样蛋白 (Aβ)损伤模型 原代培养的神经元建立阿尔兹海默病模型能够相对较好地模拟在体神经元的病变，但存在培养系统不稳定，重复性和同一性较差等问题，因此PC12细胞越来越多的用于研究阿尔兹海默病病理，在实验研究中经常采用Aβ的活性片段Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡建立阿尔兹海默病的细胞模型［20］，损伤的浓度通常为20 ～30 μmol/L，时间为 24 h。雷公藤提取物［21］、人参皂苷 Rb1［22］等均有保护作用。

1.3 其他损伤模型 近年来，帕金森病和阿尔兹海默病的细胞模型的研究中发现几乎全部的神经毒素都能使PC12细胞产生氧化应激，氧化应激是凋亡的中介物，凋亡又被认为是神经退化性疾病病理变化的一个重要环节，因而有更多研究者建立PC12的氧化模型研究其机制。在体内，各种途径可以产生的活性氧 (ROS)，包括过氧化氢(H2O2)、一氧化氮 (NO)、过氧自由基等，其中H2O2是最常用的外源刺激PC12的氧化物质，0.5 mmol/L H2O2处理细胞后，细胞存活率降至50%左右［23-24］。

与给予氧化损伤相对的是在PC12细胞上建立氧糖剥夺模型 (oxygen-glucose-deprivation)，即使用无糖无血清培养基，置于充入95%N2和5%CO2的低氧小室，随着时间的增加 (12～48 h)，细胞活力逐渐下降 (68% ～20%)［25-26］。此外，氯胺酮［27］、甲醛［28］、酒精［29］及单壁碳纳米管［30］等也可引起PC12的损伤。

2 对PC12细胞损伤具有保护作用的天然产物

通过PC12细胞建立的上述各种实验模型，可以筛选对PC12细胞有保护作用，具有治疗疾病潜能的有效物质。近年来已通过此模型筛选得到多种中药活性成分。

2.1 具有保护作用的植物提取物 银杏叶提取物 (EGb)是从银杏科植物银杏Ginkgo biloba的叶片中提取的有效成分，在百草枯诱导PC12细胞凋亡模型中，EGb761的成分是24%黄酮苷，6%萜类和其他组成成分，预处理后细胞存活率由 53.3% 上升到 82.4%［9］。EGb761对 H2O2、MPP+造成的PC12细胞损伤均有保护作用［31-32］。菟丝子是临床常用中药，为旋花科植物菟丝子Cuscucta chinensisLam.干燥成熟的种子。菟丝子提取物 (100 mg/L)能提高MPP+损伤的PC12细胞存活率约28.7%，凋亡比率由31.9% ±2.8%降低到6.3% ±0.16%［33］。枸杞提取物对MPP+诱导的PC12细胞神经毒性具有保护作用，能够抗氧化及恢复谷胱甘肽 (GSH)水平，MTT法检测细胞存活率从57.45% ±10.45% 上升至79.15% ±9.93%［34］。谷精草为谷精草科植物谷精草Eriocaulon buergerianumKoern.的干燥带花茎的头状花序，对6-羟基多巴胺诱导的PC12细胞损伤具有保护作用，其作用机制可能与降低NO的产生量和一氧化氮合酶 (iNOS)的表达量有关［13］。雷公藤提取物保护Aβ损伤的PC12细胞，其机制与拮抗细胞内Ca2+增加和抑制细胞凋亡有关［21］。贯叶连翘Hypericum perforatumL.富含黄酮类化合物，可以保护H2O2作用的PC12细胞，增加细胞存活率，降低乳酸脱氢酶 (LDH)的水平［35］。

2.2 活性成分

2.2.1 黄酮类 原花青素在Aβ25-35诱导PC12的损伤中可以抑制凋亡以及细胞在S期的阻滞，使p53蛋白的表达增加［36］，进而增加细胞存活率，保护PC12细胞。葛根素对Aβ［37］、MPP+［38-39］、H2O2［40］诱导 PC12 的损伤均有抗凋亡的保护作用，降低对PC12细胞的损伤。木犀草素通过抑制神经突生长，增加细胞的抗氧化能力保护细胞［41］。H2O2可以引起PC12细胞钙通道蛋白的调节异常和ROS的爆发，槲皮素通过拮抗该作用提高细胞存活率［42］。

黄芩苷和黄芩素是一种黄酮类化合物，可以抑制PC12细胞缺血性损伤后ROS的产生以及p38的激活，从而保护PC12细胞［43］。黄芩素可以抑制H2O2引起的PC12细胞的氧化损伤和凋亡［44］。灯盏乙素的结构是4，5，6-三羟基黄酮-7-葡萄糖醛酸苷，对低氧糖模型具有保护作用，可以减少LDH释放，降低Ca2+水平和凋亡率［45］。金丝桃苷又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷，在H2O2以及叔丁基过氧化氢诱导细胞凋亡的模型中，通过抗氧化抑制PC12细胞凋亡［46］。从豆科植物中提取的黄豆苷元和染料木苷对6-羟基多巴胺具有细胞毒保护作用［47］。淫羊藿苷是从淫羊藿Epimedium davidiiFranch中提取的黄酮类化合物，可以抑制tau蛋白的过磷酸化，保护Aβ对PC12细胞的损伤［48］。Bu-7(化合物1)是从黄皮Clausena lansium中提取的一种类黄酮，通过恢复线粒体膜电位，抑制鱼藤酮诱导蛋白的过磷酸化，调节蛋白的表达保护PC12细胞，且化合物1本身不会引起细胞的凋亡［19］。橙皮素也可保护H2O2损伤的PC12 细 胞［49］。从 知 风 草Eragrostis ferruginea(Thumb)Beauv中提取了1种新黄酮化合物7-demethylageconyflavone(化合物2)和5种已知黄酮化合物tricin(化合物3)、ageconyflavone A(化合物4)、corylin(化合物5)、nectandrin B(化合物6)、4-ketopinoresinol(化合物7)均能使PC12细胞的EC50升高［50］。化合物结构见图1。

2.2.2 生物碱类 Neoechinulin A(结构见图2)是海洋真菌中提取的吲哚类生物碱，它通过降低三磷酸腺苷 (ATP)水平保护鱼藤酮损伤的PC12细胞［51］。在MPP+建立的帕金森模型中，Neoechinulin A可以改善线粒体复合物Ⅰ的合成而减少细胞毒作用［52］。

小檗碱是一种苯并异喹啉类季铵型生物碱。Kwon等研究小檗碱对陕西省尔兹海默病引起的细胞损伤的保护作用，发现它能抑制细胞凋亡，增加细胞存活率［53］。胡椒碱通过抗氧化作用保护MPP+损伤的PC12细胞［54］。

2.2.3 酚酸类 表没食子儿茶素没食子酸酯占绿茶多酚的25%～40%左右，是绿茶中的主要活性成分。表没食子儿茶素没食子酸酯对百草枯［10］、MPP+［55］、6-羟基多巴胺［14］诱导的PC12细胞凋亡均具有保护作用。益智仁原儿茶酸对H2O2［56］，MPP+［57］、鱼藤酮［58］损伤的 PC12 细胞通过抗凋亡发挥其神经保护作用。

图1 几种具有神经保护活性的黄酮类化合物的结构式

图2 Neoechinulin A结构式

2.2.4 糖苷类物质 红景天苷属于类苯基丙烷苷类，在MPP+的损伤过程中可以提高PC12细胞的存活率，并且首次发现红景天苷可通过抑制NO通路来保护PC12细胞对抗MPP+诱导的凋亡［7］。红景天苷也可保护低糖低血清、H2O2损伤的 PC12 细胞［25，59］。松果菊苷是葡糖苷类化合物，可以保护H2O2损伤的PC12细胞，提高细胞的存活率，降低凋亡率［60］。芍药苷可以保护MPP+以及酸损伤引起PC12细胞的自噬，下调LC-3等自噬蛋白的表达［8］。南岭柞木苷G(结构见图3)与聚集状的Aβ25-35共同孵育，可提高细胞存活率，流式细胞仪检测凋亡率从34.26%降低到22.62%，并伴随ROS的产生［61］。

图3 南岭柞木苷结构式

2.2.5 皂苷类 人参皂苷是三萜皂苷，包含多种成分:人参皂苷Rg1通过抑制NF-κB的激活保护H2O2损伤的PC12细胞［62］。通过增加细胞存活率，抑制LDH和NO的释放保护Aβ损伤的PC12［63］。人参皂苷Rb1通过清除ROS，抗氧化保护Aβ对PC12的损伤［22］。人参皂苷Rb3在氧糖剥夺模型中起保护作用［64］。人参皂苷Rd在氧糖剥夺模型和H2O2损伤模型中，均提高抗氧化酶的活性起到抗氧化的作用而保护 PC12细胞［65］。人参皂苷Re在 Aβ或无血清对PC12造成的损伤中，提高细胞存活率、降低LDH水平，保护细胞受损［66］。远志皂苷是五环三萜类皂苷，保护H2O2造成的PC12细胞的损伤［67］。低氧可以诱导PC12细胞的损伤，大蒜总皂苷可以保护低氧诱导PC12细胞的损伤［68］。

2.2.6 萜类 桃叶珊瑚苷 (结构见图4)属于环烯醚萜苷类，对H2O2损伤的PC12细胞具有保护作用［69-70］，增加细胞存活率，降低凋亡率。梓醇主要存在于地黄Rehmannia glutinosa等植物中，在氧糖剥夺和氧化损伤模型中起神经保护作用［71-72］。胡黄连苷-Ⅱ (结构见图 4)可以协助PC12细胞抵抗H2O2的氧化损伤作用［73］。MPP+或H2O2损伤PC12细胞后，齐墩果酸、乌索酸能提高细胞存活率［74］。科罗索酸 (结构见图4)来源于大花紫薇Lagerstroemia speciosa的提取物，在低氧糖模型中，可显著提高细胞活力，降低上清液LDH水平，增强损伤细胞内Na+-K+ATP酶活，保护PC12细胞［75］。白果内酯是银杏叶提取物的主要有效成分，对于Aβ损伤的PC12细胞具有保护作用［76］。

2.2.7 苯丙素类 和厚朴酚与厚朴酚是具有酚式羟基的木脂体，可以保护Aβ对PC12细胞的神经毒性作用［77］。五味子乙素是从五味子中提取出来的活性物质，可以保护百草枯对PC12细胞的损伤［11］。紫花前胡素提高了PC12细胞对Aβ氧化损伤的抵抗作用［78］。蛇床子素通过减少产生降低MPP+对PC12细胞的损伤，抑制凋亡，达到保护目的［79］。

图4 几种具有保护作用的萜类化合物结构式

2.2.8 其他 姜黄素是二酮类化合物，低浓度姜黄素可以拮抗鱼藤酮、MPP+致PC12细胞的损伤［80-81］。姜黄素也可以抑制Aβ对PC12细胞的氧化损伤［82］、减弱H2O2对PC12细胞的损伤［23］。花生四烯酸可以抑制低氧引发的细胞内Ca2+水平的升高，保护PC12细胞［83］。大麻二酚 (结构式见图5)能拮抗 Aβ1–42导致的PC12细胞内亚硝酸盐的增加，使细胞免于损伤［84-85］。

图5 大麻二酚结构式

3 结语

对PC12细胞损伤具有保护作用的中药活性成分，具有开发成为治疗神经性疾病天然药物的潜在价值，在细胞水平上的研究表明保护的机制与ROS以及凋亡有关，活性天然产物针对凋亡途径的关键步骤进行保护，例如拮抗细胞内钙超载［22］，抑制 ROS 和氮氧基 (NO·)的产生［7，66］，导致下游凋亡蛋白的调节［42］。研究PC12细胞的损伤保护机制，可以针对靶点筛选大量化合物，为神经系统退行性疾病药物开发研究提供依据。目前，PC12的细胞模型仍在不断的发展和进步中，新的诱导物蛋白酶体抑制剂能有效地抑制泛素-蛋白酶体系［86］，中药活性成分在该模型上尚未进行筛选研究。PC12细胞易获得、可传代，可以快速方便的进行初期筛选，然后在此基础上进一步在神经元和动物体内进行神经药理研究，达到有效提高研究效率，节约研究成本之目的，PC12细胞模型的建立对于神经退行性疾病的天然药物筛选具有重要意义。

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