城市生活污水对斑马鱼肝脏组织结构和NF-κB基因表达的影响

甘海燕，杨竹青，王自蕊，隗黎丽

(江西农业大学 动物科学技术学院，江西 南昌 330045)

城市生活污水常常含有大量的有机污染物、细菌和病毒，同时还含有一些寄生虫卵及化学有害物质[1]。这些物质对水生生物具有毒害作用，但其有毒化合物的成分复杂，且浓度较低，难以全面评价它们对水生生物的毒性效应[2]。如将它们作为一个整体来评估其危害则更加可靠[3]。近年来，废水和水污染物对鱼的生物效应研究在国内外越来越受到重视[4]，因鱼类的生理系统具有与哺乳动物类似的特点，水污染物对鱼类毒性影响的结论可以应用到其它脊椎动物，也可以据此预测、推测污染物对人类健康可能产生的影响。在江苏省，环境保护部门已开始尝试用鱼类来监控敏感化工项目排水的毒性，并取得了较好的效果[5]。

斑马鱼(Danio rerio)作为模式生物的地位早已在国际上被普遍认可，被广泛应用于发育生物学、基因组学、蛋白组学及功能组学研究。而最近10年来，国内外已广泛运用斑马鱼作为动物模型进行生态毒理研究。刘在平[6]曾研究过城市污水对斑马鱼仔鱼的毒性作用及对斑马鱼胚胎的影响;张青碧[7]开展了城市生活污水对水生动物斑马鱼的发育毒性的研究;吴玲玲[8]以斑马鱼为研究对象报道了生活污水中菲对斑马鱼鳃和肝脏组织的影响。然而目前还没有关于生活污水对鱼类细胞因子影响的报道，核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是一种重要的多极性细胞转录核因子，能够调控多种与炎症有关的细胞因子，参与机体免疫、炎症和细胞再生、凋亡等过程，其过度活化可引起多种病理生理反应[9]。为了更全面地评价生活污水的毒性效应，本研究以南昌市鹏鹞污水处理厂(南昌市鹏鹞污水处理厂服务范围包括红谷滩新区、红谷滩周边地区、凤凰洲新区及红角洲开发区)泵进的污水作为研究对象，探讨其对斑马鱼肝脏的组织学结构和基因表达的影响，以便为污水处理和管理部门提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

斑马鱼购买于南昌市千花伴花鸟鱼市场，体长为2～4 cm，体质量为5～10 g，无病无伤，在实验室暂养一周后用于实验。生活污水采自南昌市鹏鹞污水处理厂未经处理的生活污水，普通定性滤纸去除悬浮物，抽滤后的水样于4℃保存，然后用于暴露实验。

1.2 实验方法

1.2.1 实验鱼处理 将在实验室暂养1周后的斑马鱼随机分成4组，每组50尾金鱼。第1组为对照组，2、3、4组分别为100%、50%和25%的实验处理组。试验用水为曝气充氧除氯24 h以上的自来水，试验期间投食，采用自然光照，每24 h更换试验液1次。分别在暴露后的第4天、7天和14天取斑马鱼的肝脏，每组取3尾鱼肝脏投入Bouin氏液中固定制作组织切片，同时每组取5尾鱼的肝脏混合，放入液氮中冻存提取RNA用RT-PCR测定NF-κB基因的表达水平的变化。

1.2.2 组织切片的制备 石蜡切片的制作步骤包括取材、固定、洗涤、脱水、透明、包埋、切片、展片、贴片、染色和封片步骤。固定的组织用流水冲洗12～14 h;经过70%、80%、85%、95%(2次)、100%(2次)乙醇分别脱水60 min、60 min、60 min、45 min和45 min;经二甲苯透明至组织透明状;选择熔点为56～60℃的石蜡进行包埋，包埋时组织切口朝下;用切片机切片(厚7 μm);置于45℃的水浴中展片、贴片;贴片后置于37℃恒温箱内烘干;烘干的切片采用苏木素－伊红(H·E)法进行染色;染色后晾干，然后用中性树胶封片。将制作的切片置于LEICA DM 2500生物显微镜下观察，并拍照，读片。

1.2.3 RT-PCR分析 取出液氮中冻存的肝脏组织，用Trizol(Invitrogen)提取斑马鱼肝脏组织的总RNA，1.2%TAE琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量。将所提取的RNA样品，用20 μL DEPC水溶解，用紫外分光光度计测出每个RNA样品的浓度。取5 μg总RNA进行反转录合成cDNA，所用试剂盒为RevertAid TM Fisrt Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)，操作步骤按其说明书进行。根据GenBank上公布的斑马鱼的序列，用Primer Premier 5.0软件进行引物设计，优化退火温度并扩增得到预期片段(表1)。

表1 目的基因及内参基因的引物Tab.1 Primers of target and internal control genes

采用双管法，以GAPDH基因为内标，用斑马鱼肝脏cDNA在同等条件下分别扩增GAPDH和NF-κB。20 μL 反应体系中含 1.0 μL cDNA 模板，正反向 PCR 引物各 0.5 μL(10 μmol/L)，0.5 μL dNTP(10 μmol/L)，2.5 μL 10 × Buffer，0.2 μL ExTaqE(TaKaRa)，加灭菌水补充到20 μL 体系。反应程序如下:94℃预变性5 min，相应的退火温度(表1)30 s，72℃ 60 s，相应的最佳循环数(35，35)，最后72℃延伸5 min。本实验PCR产物用EB染色，在TAE电泳缓冲液中以15 g/LTAE琼脂糖凝胶电泳，凝胶电泳显像仪拍照，用Quantity One软件进行定量分析。

2 结果

2.1 行为观察

在染毒实验期间，对照组和处理组的受试鱼均未发生死亡。与对照组相比，暴露在浓度为25%浓度的污水溶液中，受试鱼未发生明显的行为异常，但100%浓度暴露下，受试鱼的活动减少，少数鱼间歇停留在鱼缸底部。

2.2 石蜡切片观察

2.2.1 斑马鱼对照组肝脏组织 对照组斑马鱼的肝细胞呈多角形，形状变化不大，胞质均匀、清晰，细胞界限清楚，细胞核圆球形或不规则形，位于中央，核内有1个或2个核仁。细胞间的窦状隙明显，肝细胞索相互交错(图1)。

2.2.2 斑马鱼在污水中暴露4 d后肝脏组织的变化 斑马鱼在25%浓度的生活污水中暴露4 d后，肝窦隙稍有扩张，其他病变不明显(图2－A);斑马鱼在50%浓度的生活污水中暴露4 d后，肝细胞轻微肿胀，细胞核偏离中央(图2－B);斑马鱼在100%浓度的生活污水中暴露4 d后，细胞界限模糊，部分细胞核裂解，出现空泡样(图2－C)。

图1 斑马鱼对照组肝组织结构(H.E，400×)Fig.1 Structure of liver in zebrafish from control(H.E，400 ×)

图2 斑马鱼肝脏在不同浓度污水中暴露4 d后的变化(H.E，400×)Fig.2 Effects of urban sewage on the liver of zebrafish after exposure for 4 days(H.E，400 ×)

2.2.3 斑马鱼在污水中暴露7 d后肝脏组织的变化 斑马鱼在25%浓度的生活污水中暴露7 d后，细胞质模糊，部分细胞核裂解成小碎核(图3－A);斑马鱼在50%浓度的生活污水浓度暴露7 d后，细胞核偏离中央，排列紊乱，细胞核裂解量增加，空泡样增多(图3－B);斑马鱼在100%浓度的生活污水浓度试样7 d后，肝窦出现淤血，细胞肿大，部分细胞坏死(图3－C)。

2.2.4 斑马鱼在污水中暴露14 d后肝脏组织的变化 斑马鱼在25%浓度的生活污水浓度暴露14 d后，细胞肿大，细胞核裂解，出现网状(图4－A);斑马鱼在50%浓度的生活污水浓度暴露14 d后，肝窦充血，细胞界限模糊(图4－B);斑马鱼在100%浓度的生活污水浓度暴露14 d后，肝窦充血，部分细胞坏死(图4－C)。

图3 斑马鱼肝脏在不同浓度污水中暴露7 d后的变化(H.E，400×)Fig.3 Effects of urban sewage on the liver of zebrafish after exposure for 7 days

图4 斑马鱼肝脏在不同浓度污水中暴露14天后的变化(H.E，400×)Fig.4 Effects of urban sewage on the liver of zebrafish after exposure for 14 days

2.3 半定量RT-PC R

NF-κB在生活污水处理组和对照组中肝脏中的表达见图5。由图5可知，斑马鱼经25%、50%、100%浓度生活污水处理4 d、7 d和14 d后，NF-κB的表达相对于对照组明显上升。对RT-PCR产物采用Quantity One进行灰度分析发现，在处理7 d后，50%和100%浓度组的NF-κB的表达相对于GAPDH的表达明显增加，而处理14 d后，这种表达变化更明显，3个浓度组的NF-κB的表达均显著增加，分别为2.36 倍、2.67 倍和2.91 倍。

图5 生活污水对斑马鱼NF-κB表达的影响Fig.5 Expression of NF-κB mRNA in zebra fish after exposed to urban sewage

3 结论与讨论

肝脏是鱼类最大的腺体，也是各种物质代谢最重要的器官之一。它不仅具有分泌胆汁，合成蛋白质，贮存糖原和脂滴的功能，而且能够中和、分解有毒物质。鱼的肝脏(或肝胰腺)是极敏感的器官，也是鱼类进行物质代谢的重要枢纽，外源异生物质主要在肝脏中进行生物转化，当鱼类暴露在受污染的水环境中一定时间，其肝组织会发生结构和生理变化[10]。斑马鱼肝脏是环境监测[11]、毒理学实验研究的重要器官[12]。一般情况下鱼类受到毒物作用后，肝细胞通常会发生肿大、空泡化和坏死[13]。李莉等[14]将稀有鮈鲫暴露在生活污水中，电镜观察肝细胞发现肝细胞在生活污水的胁迫下细胞的形态结构发生了明显的变化，无论是长期或是短期、低浓度或高浓度的暴露，细胞核均严重变形，核仁扩大，细胞器遭到损坏，脂滴大量出现且增大。本研究的结果表明斑马鱼暴露在生活污水中，肝脏组织会发生病变，主要表现在肝窦隙扩张，细胞核肿大甚至裂解消失，胞质疏松，空泡明显增加。这与以往报道的有毒物质对鱼类肝细胞的毒害以及由于环境污染而引起的鱼类肝细胞组织结构的变化结果相一致。此外，本研究还发现随着暴露浓度的增加和暴露时间的延长，斑马鱼肝脏组织损伤更严重。

NF-κB是一种能与体内多种细胞基因启动子部位相结合的核蛋白，可调节多种细胞因子和炎性介质表达。余海放和聂虎[15]报道百草枯作用血管内皮细胞8 h后，就能促使NF-κB明显活化，促发和推进炎症反应。活化的NF-κB可调控炎性细胞因子在肝脏的分泌，加重肝细胞损伤[16]。本实验研究发现斑马鱼在受到生活污水处理后，NF-κB的表达上调，并且随着污水的浓度的增加和处理时间的延长，表达变化更明显，这与组织切片的结果相一致。通过以上组织结构和基因表达的分析，直接排放的生活污水中的有毒有害物质会对鱼类产生毒性效应，造成解毒器官肝组织损伤，并可引起NF-κB基因的激活，促进炎症反应的发生。为保护水生生物赖以生存的水环境并确保人类饮用水的安全，应加强对生活污水的管理和控制。

致谢:感谢江西农业大学动物生物技术国家重点实验室的艾华水老师在切片的显微拍照中给予的指导，感谢南昌市鹏鹞污水处理厂在采样中给予的大力支持，感谢水产081班的王元涛、金鑫、刘小鹏等同学在实验过程中的大力帮助。

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