响应面法优化樟树叶精油水蒸汽蒸馏提取工艺

胡文杰，高捍东，江香梅

(1.南京林业大学 森林资源与环境学院，江苏 南京 210037;2.江西省林业科学院 国家林业局樟树工程技术研究中心，江西 南昌 330032)

樟树(Cinnamomum camphora(L.)Presl.)属樟科樟属树种，为我国二级保护植物。樟树材质优良，是江南四大名木之一;树体伟丽多姿，树冠宽大，四季常青，是我国南方园林景观绿化美化和生态环境建设使用最多的树种;根、茎、枝、叶富含精油，其精油的主要化学成分有芳樟醇、樟脑、黄樟油素、桉叶油素、异橙花叔醇、龙脑、松油醇、a－蒎烯、莰烯、丁香酚和香叶醇等，是我国用量最大的传统天然香料之一，也是重要有效药用成分[1－2]，被广泛应用于香精香料、医药、化工、食品和烟草等工业;种子中富含中碳链脂肪酸，是功能性油脂、生物能源等的重要原料。因此，樟树是一种集材用、药用、香精香料、油用、风景园林等一体的多用途林木资源，被誉为江南宝树[3]，具有巨大开发利用价值。

有关樟树枝叶精油提取方法较多，主要有水蒸汽蒸馏法[4]、气体吸附法[5]、溶剂浸提法[6]、超临界CO2萃取法[7]等。水蒸气蒸馏法是使用最多的提取方法，主要原因是提取设备简单，容易操作，成本低，提取溶剂为水，对环境友好，无三废排放，因此备受青睐。本文旨在对影响水蒸气蒸馏法提取樟树叶精油提取率的3个主要因素提取时间、水料比、提取功率，在单因素试验基础上，进一步利用3因素3水平的响应面分析方法进行优化试验，再采用回归分析方法对其相互关系通过拟合得到回归方程，优化出最佳工艺参数，为提高樟树叶精油提取率和质量提供优化工艺。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在江西省林业科学院内，选择樟树中油樟化学类型的10棵植株作为样株，分别2次采集叶样:一是于2012年2月下旬、自然落叶前采集，这一时期的叶片代表生理老叶，叶片中精油含量相对较低;二是于5月下旬、叶面积和叶重增加基本稳定时采集，这一时期的叶片代表生理新叶，叶片中精油含量相对较高。因为这两个时期叶的精油含量差别很大。每次采样时，每棵植株称取200 g新鲜叶样充分混匀后，作为试验用叶样品。

1.2 试验方法

1.2.1 叶精油水蒸汽蒸馏法 在自制水蒸汽蒸馏器中加入适量沸水和新鲜樟树叶，加热蒸馏，蒸馏时产生的共沸蒸汽经冷凝管冷凝后滴入水分离器而分为两相，水相在下层。上层的精油经水分离器的旋塞放出，称重，计算其精油提取率。

1.2.2 试验设计方法 (1)单因素试验设计。对影响樟树叶精油提取率的3个关键因素提取时间、水料比、提取功率分别进行单因素试验，初步筛选出各试验因素中的优化水平。各因素各水平试验设计见表1。

表1 单因素试验设计Tab.1 The single factor experiment design

(2)响应面优化试验设计。以各因素单因素优化试验结果为基础，以樟树叶精油提取率为响应值，进一步进行3因素3水平的响应面法试验[8－9]。设计时，两次提取试验的因素不变，试验水平则略有差异，详情见表2。根据方程 Xi=(xi－x0)/Δx对自变量进行编码(Xi为自变量的编码值，xi为自变量的真实值，x0为试验中心点处自变量的真实值，Δx为自变量的变化步长)，i=1，2，3。

表2 两次试样响应面法试验因素与水平设计Tab.2 Factors and levels of response surface methodology for two times

1.2.3 樟树叶精油提取率计算 精油提取率(%)=(精油重/鲜叶重)×100%

1.2.4 优化工艺验证 以单因素试验、响应面优化试验确定的最佳工艺和修正后的响应面最佳工艺条件，分别进行叶精油提取试验，比较叶精油提取率，验证优化工艺。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取时间对精油提取率的影响 由图1可知，两次试样提取结果均表明:樟树叶精油提取率随提取时间由40 min增加到60 min时，精油提取率显著提高，2月试样由0.502%提高到1.334%，5月试样由1.143%提高到2.051%。然而随着提取时间的进一步增加，精油提取率增加缓慢，最后基本稳定在一个恒定值上。这是因为随着提取时间的延长，原料叶中的精油逐渐被提取完，即使进一步延长提取时间，提取率也不再增加。两次试样提取结果的变化趋势完全一致。综合考虑能耗、生产成本等方面的因素，认为60 min为适宜提取时间。

图1 提取时间对提取率的影响Fig.1 Effects of extracting time on the extracting rate

图2 水料比对提取率的影响Fig.2 Effects of water to material ratio on the extracting rate

2.1.2 水料比对精油提取率的影响 由图2可知，随着水料比的增加，精油提取率呈先快速提高后稳定在一个值上的变化趋势。在水料比由7.5∶1增加到12.5∶1时，提取率显著增加，2月试样由0.691%提高到1.322%，5月试样由1.197%提高到2.050%，接近于最大值;当水料比继续增加到15.0∶1以上时，提取率基本不再提高，两次提取试验结果完全一致。这是因为水料比也是精油提取过程中一个重要的影响因素。水料比过低，水散作用进行得不彻底，必将影响出油率;而水料比过高，又会导致精油在水中的溶解度增大，从而使精油得率降低[10]。同时能耗也随之增加，造成能源的浪费。综合能耗和提取得率两方面因素，认为水料比以12.5∶1为佳。

2.1.3 提取功率对精油提取率的影响由图3可知，精油提取率随提取功率呈先快速增加再趋于稳定的变化趋势。提取功率由400 W增加到1 200 W时，精油提取率接近于最大值，2月试样为1.377%，5月试样为2.127%;提取功率继续增加，精油提取率则基本不再提高。两次提取试验结果完全一致。故选择1 200 W为最佳提取功率。

图3 提取功率对提取率的影响Fig.3 Effects of extracting power on the extracting rate

2.2 响应面分析法优化樟树叶精油的提取工艺

2.2.1 响应面试验测定结果与分析 以单因素试验筛选的优化水平为基础，进一步进行3因素3水平共15个试验点的响应面试验，其中第1～12试验点为析因试验点，13～15试验点为中心试验点，用来估计试验误差。

采用Design Expert 8.05 b等软件对所得数据进行ANOVA分析，分析结果(表3)表明，两次试样提取率最高的试验处理均在试验4号为最高，2月试样的提取率为1.378%，5月试样的提取率为2.135%。

表3 响应面试验方案及结果Tab.3 Experiment design and results of response surface methodology

通过拟合，得到两次试样精油提取率响应面的两个二次多元回归方程为:

对上述两个回归模型自变量和应变量之间的线性关系进行方差分析，结果见表4。由表4可知，两个回归模型均达到极显著水平，说明上述回归模型中，各因素与响应值之间的线性关系是合理可行的。两个模型中预测值与试验值之间的相关系数分别为R2=0.9791和R2=0.9780，说明两次提取试验提取率的试验值与预测值之间有较好的拟合度。

两次试验回归模型中各项因子的方差检验结果(表4)还表明，在一次项因子中，达到极显著水平的因子为X1，达到显著水平的因子为X3，X2的差异未达到显著水平。在二次项因素中，X12的影响达到显著水平，X22和X32均达到极显著水平;而在3对交互作用项中，仅X1X2项的影响达到显著水平，其它项不显著。

表4 回归方程的方差分析及其系数的显著性检验Tab.4 Analysis of variance for the fitted quadratic equation and significance test of the regression coefficients

2.2.2 交互作用项等高线图和响应面分析 在响应面分析法中，通常用响应面图和等高线的形状来直观地反映两个因素交互效应的大小。圆形表示交互作用不显著，椭圆形则表示交互作用显著。

(1)提取时间与水料比交互项对提取率的影响。由图4和图5可知，无论是2月试样还是5月试样，提取时间与水料比的交互作用的响应面图和等高线均呈椭圆形，说明其交互作用达显著水平。且等高线沿时间轴方向变化相对密集，说明提取时间对精油提取率的影响比水料比大。这与单因素项的试验结果一致。

图4 Y=f(X1，X2)的响应面图和等高线图(2月下旬)Fig.4 Responses surface plot and contour plot of Y=f(X1，X2)(Late February)

(2)提取时间与提取功率交互项对提取率的影响。由图6和图7可知，提取时间与提取功率的交互作用虽然在统计意义上未达到显著水平，但其等高线还是呈较典型的椭圆形，达到较显著水平。此外，沿时间轴方向的等高线密度变化明显高于提取功率方向的变化。说明提取时间对樟树叶精油提取率的影响要大于提取功率。

图5 Y=f(X1，X2)的响应面图和等高线图(5月下旬)Fig.5 Responses surface plot and contour plot of Y=f(X1，X2)(Late May)

图6 Y=f(X1，X3)的响应面图和等高线图(2月下旬)Fig.6 Responses surface plot and contour plot of Y=f(X1，X3)(Late February)

图7 Y=f(X1，X2)的响应面图和等高线图(5月下旬)Fig.7 Responses surface plot and contour plot of Y=f(X1，X3)(Late May)

(3)水料比与提取功率交互项对提取率的影响。由图8和图9可知，水料比与提取功率的等高线接近圆形，说明其交互作用不显著。但等高线密度沿水料比轴方向略大于提取功率方向，说明水料比对精油提取率的影响要大于提取功率。

2.2.3 验证性试验 采用Design－Expert 8.5 b软件分析两次试验测试结果，可得出最大响应值(Y)时对应的编码值。其中:2月试样的结果为:X1=1，X2=0.33，X3=0.23;根据编码值与非编码值的转换式解得响应面法对樟树叶精油提取条件的最佳工艺条件为:提取时间(x1)=70 min，水料比(x2)=13.325∶1，提取功率(x3)=1 292 W。在此工艺条件下，其最大精油提取率理论值为1.453%。

图8 Y=f(X2，X3)的响应面图和等高线图(2月下旬)Fig.8 Responses surface plot and contour plot of Y=f(X2，X3)(Late February)

图9 Y=f(X2，X3)的响应面图和等高线图(5月下旬)Fig.9 Responses surface plot and contour plot of Y=f(X2，X3)(Late May)

5月试样的结果为X1=1.00，X2=－0.01，X3=－0.06;根据编码值与非编码值的转换式解得响应面法对樟树叶精油提取条件的最佳工艺条件为:提取时间(x1)=65 min，水料比(x2)=12.495∶1，提取功率(x3)=1 194 W。在此工艺条件下，其最大精油提取率理论值为2.151%。

为了验证响应面法的可行性和可靠性，采用以上两次试验研究筛选的最佳提取工艺条件，分别于2月和5月两次采集樟树叶样，每次采集的叶样均进行5次重复提取试验。最后得出，两次试样平均提取率分别为1.427%和2.139%，与理论值的相对误差分别为1.79%和0.56%。两次试验的验证值与回归方程的理论预测值吻合得很好。因此，响应面法对樟树叶精油提取条件的优化是合理可行的。

3 结论与讨论

3.1 取样时间对精油含量的影响

樟树各部位都含精油，因树龄、立地条件、树体部位和采集季节不同，其含量存在较大差异[11]。因此，本试验于2月下旬和5月下旬分别采集樟树叶样进行叶精油的提取试验，其原因是樟树一般于3月中下旬到4月上旬换叶，老叶脱落，新叶萌生。因此，2月取样叶代表落叶前的老叶，而5月取样叶代表叶面积和叶重量均达到最大的稳定状态的新叶。试验结果表明，老叶和新叶中精油含量差别很大，前者仅为1.43%左右，而后者可达2.13%左右。可见，原料采集时间是决定精油得率的关键因素。

3.2 基于响应面法的水蒸气蒸馏法最佳提取工艺条件的确定

在原料最佳采集时间确定后，如何达到最佳提取效果，则需要确定最佳提取条件。本研究用2月试验和5月试样分别进行提取条件优化试验，获得了两个回归模型和两套最佳提取工艺条件。即:2月试样的最佳提取工艺参数为:提取时间(x1)=70 min，水料比(x2)=13.325∶1，提取功率(x3)=1 292 W;5月试样的最佳提取条件为:提取时间(x1)=65 min，水料比(x2)=12.495∶1，提取功率(x3)=1 194 W。这两套优化提取条件存在的差异，主要来源于如下两个方面:一是老叶和新叶本身对提取条件的要求存在差异;二是5月试样在试验水平设计上与2月试样略有不同，5月试样提取时，是在总结2月试样提取试验经验的基础上，将3个因素的试验水平在单因素试验确定的最优水平上，进一步缩小试验水平梯度，达到更精细设计的目的。用5月试样分别用两套优化提取条件进行5次重复提取试验，结果表明:用2月试样的优化条件提取的平均提取率为2.145%;用5月试样的优化条件提取的平均提取率为2.139%。两套方案的精油提取得率十分接近。但两套提取方案的能耗却存在较大差别，后者提取时间可缩短5 min，提取功率可降低98 W，水的用量也可以减少6%以上。因此，综合考虑的结果，认为以5月试样筛选的提取条件为佳。为实际操作时简便起见，将优化提取条件简化为:提取时间65 min，水料比12.5∶1，提取功率 1 200 W。

3.3 响应面分析法在樟树精油成分提取方面的应用效果

响应面分析法是通过中心组合试验，同时研究多种试验因素间交互作用的一种回归分析方法，具有试验次数少、周期短，求得的回归方程精度高等优点，并能通过图形分析较直观地寻求最优试验考察因素值[12]，克服了传统数理统计方法数据量较大，无法考虑各因素综合作用的缺点。本试验结果表明，响应面分析法对樟树叶精油提取条件优化具有重要指导作用，在相关研究领域也将有广阔的应用前景[13]。

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