羽衣甘蓝DH群体遗传多样性分析

戴希刚，包满珠

(1.江汉大学 生命科学学院，湖北 武汉 430056;2.华中农业大学 园艺林学学院，湖北 武汉 430070)

羽衣甘蓝(Brassica oleracea var.acephala)，是十字花科芸薹属甘蓝种的一个变种，两年生草本植物，观叶为主。由于耐寒性强，观赏期长，其已成为我国乃至全世界冬春季应用最为广泛的观赏植物[1]。利用小孢子培养技术，能快速获得育种急需的遗传稳定材料和创造新的种质资源，提高育种效率。小孢子培养所得植株加倍后获得的双单倍体构成的群体被称为DH群体，由DH群体组成的育种品系就叫DH系，它在遗传上是完全纯合的，可以直接作为优良亲本应用于品种改良[2]。小孢子培养获得的DH群体由于发生基因分离重组，染色体结构发生变化，故群体内存在较大的遗传多样性。目前利用已较成熟的小孢子培养技术可以快速从F1中获得DH群体[3－5]，但有关DH群体遗传多样性或遗传差异的研究却很少见报道。

分子标记是分析种质遗传多样性的有效工具。ISSR标记因其操作简单、成本低，信息量大、多态性高、重复性和稳定性强等优点[6]，现已被广泛用于植物遗传多样性研究。齐迎春等[7]利用ISSR标记对12份孔雀草自交系和4份孔雀草F1代及两份万寿菊材料进行了遗传分析，ISSR分类结果将18份材料按照自交系和杂合系及孔雀草的来源分为三大类。Zhang等[8]利用ISSR技术分析了来自中国9个种群的245个诸葛菜个体的遗传变异性，种群间存在80.8%的遗传变异，种群间存在16.43%的遗传变异。Talebi等[9]利用ISSR技术对不同国家的47个基因型的Brassica rapa的遗传多样性和遗传关系进行了评价，结果发现中国与欧洲的基因型间存在相当大的遗传变异。而利用ISSR标记技术进行DH群体遗传多样性的研究报道很少。

本研究利用ISSR标记技术，对两个基因型羽衣甘蓝(“名古屋－红”、P3)的DH群体的遗传多样性进行研究，并采用系统聚类法将两个基因型产生的DH系进行聚类分析，为选用遗传差异较大的DH系进行杂交配组，选育出综合性状优良的杂交一代品种提供参考，为利用DH群体进行羽衣甘蓝杂交育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

从基因型“名古屋－红”经小孢子培养获得的DH群体中抽取46个株系，基因型P3(Q2704×Q4606的F1代)经小孢子培养获得的DH群体中抽取41个株系，作为本研究的试验材料。

1.2 DNA 的提取

分别从供试材料各单株上取幼嫩叶片，参照王灏等[10]的方法，用稍作改良的CTAB小量法提取基因组DNA。

1.3 ISSR 扩增

1.3.1 扩增体系及程序 ISSR引物为本实验室自行设计，由上海生工合成。PCR反应体系为20 μL，其中包括 2 μL 的 10 ×Buffer、1.5 mmol/L 的 MgCl2、0.2 mmo1/L 的 dNTP、1 U Taq DNA 聚合酶、0.5 μmol/L引物、20 ng模板DNA。扩增反应程序为:94℃预变性4 min，先94℃变性30 s，58复性45 s，72℃1 min 30 s，接着梯度降温进行复性，5个循环后稳定在53℃复性，进行38个循环，最后72℃延伸10 min。PCR反应在PTC－100TM(Bio-Rad，USA)PCR仪上进行，扩增产物在4℃下保存。

1.3.2 扩增产物的PAGE电泳检测 ISSR扩增产物加4 μL上样缓冲液，在DYCZ-30型电泳仪上进行非变性凝胶电泳分离。凝胶成分包括80 g/L聚丙烯酰胺、0.4 g/L过硫酸铵、0.5 g/LTEMED，电泳缓冲液为TBE，120 V电泳2～3 h。DNA片断的分子量大小根据100 bp DNA Marker电泳迁移距离确定。用银染法显带，显带步骤为①首先用0.5%冰醋酸+10%无水乙醇固定2次，每次6 min;②2 g/L Ag-NO3银染12 min;③ddH2O清洗2次，每次30 s;④0.02 g/L Na2SO3浸泡30 s以降低背景;⑤15 g/L NaOH+0.4%甲醛显色，至条带清析;⑥7.5 g/L Na2CO3终止15 min;⑦ddH2O冲洗数次，保险膜包裹保存。

1.4 数据分析

ISSR电泳结果采取0/1赋值记带，有带记为1，无带记为0。用NTSYS-Pc 2.10e软件进行数据分析。对原始矩阵用SimQual程序求Jaccard相似系数矩阵，并获得相似系数矩阵。利用PopGene32软件计算扩增产物的多态性位点数(the number of polymorphic loci，N)、多态位点比率[the percentage of polymorphic loci(%)，P]，Shannon多样性指数 PIC(polymorphism information content，I)及有效等位基因数(effective number of alleles，Ne);利用NTSYS－Pc 2.10e软件，将由“1”和“0”生成的原始矩阵用UPGMA 方法进行聚类分析;最后均通过Tree plot模块生成聚类图。

2 结果与分析

2.1 ISSR多态性分析

选取1份材料进行预备试验，从38个ISSR引物中选取9个能够获得清晰条带，反应稳定的ISSR引物(表1)。ISSR引物对不同群体的扩增效率不一样，并且扩增的总带数和多态性带数的差异也较大。对于“名古屋－红”的DH群体，9条ISSR引物共扩增出清晰、稳定性好的多态性条带104条(图1 A)，大小在100～2 000 bp，其中多态性位点为85个，每条引物扩增的位点数为4－17条，平均11.56条;多态性位点比率为81.73%，平均多样性指数(I)为 0.258 9;每个位点的有效等位基因数(Ne)为1.225 3。对于P3的DH群体，9条ISSR随机引物共扩增出清晰、稳定性好的多态性条带87条(图1 B)，大小在 150 ～1 600 bp，其中多态性位点为69个，每条引物扩增的位点数为6～13条，平均11.56条;多态性位点比率为79.31%，平均多样性指数(I)为0.409 4;每个位点的有效等位基因数(Ne)为1.468 9。P3的DH群体的平均多样性指数比“名古屋－红”的大，说明P3的DH群体多样性比“名古屋－红”的广，且有效等位基因也较之多。这说明由P3小孢子培养得到的DH群体比“名古屋－红”所得到的DH群体的基因型更丰富。

表1 ISSR分析所用引物序列Tab.1 Sequence of primers used for ISSR analysis

图1 ISSR扩增图谱Fig.1 The profile of ISSR amplification

2.2 DH群体ISSR聚类分析

对ISSR结果进行聚类分析，结果如图 2。“名古屋 －红”的DH群体46个株系间相似系数范围为 0.61 ～0.97，其中DN35和DN42之间的相似性系数最大为 0.97，DN5 和DN6之间的相似系数最小，相似程度小的还有DN6和DN13，DN6 和 DN24，DN7 和DN13等，它们之间的相似性系数均小于0.65(图2 A)，表明这些株系之间存在较广的遗传多样性，即是说他们的遗传关系较远。对P3 DH群体的41份材料进行聚类分析(图2 B)，结果表明，各株系间的相似系数范围为0.56～0.91。其中，DP28和DP40之间的相似系数最小为0.56，而DP21与DP34之间的相似系数最大为0.91。总的看来，P3的DH群体的遗传多样性范围要比“名古屋－红”的广，即是说P3的DH群体内各株系的遗传关系较远。在相似性系数为0.78处可将46个“名古屋－红”的DH系分成5组，而在相似性系数0.75处可将41个P3的DH系分成5组。

图2 羽衣甘蓝“名古屋－红”(A)和P3(B)的DH群体ISSR聚类图Fig.2 Dendrograms of cluster analysis for DH population of ornamental kale cv.‘Red Nagoya’and P3 based on ISSR

3 讨论

通过小孢子培养技术能够在短时间内获得基因型纯合的株系。利用分子标记对获得的DH群体进行遗传多样性分析，期望不仅可以了解DH群体内部的遗传多样性情况，而且希望得到在育种上有价值的单株之间遗传背景上的差异，为选育到符合育种目标的亲本提供参考。本研究利用ISSR标记检测了2个DH群体的遗传的多样性，结果发现2个群体内均存在较大的遗传多样性，但P3的DH群体内各株系间遗传关系比“名古屋－红”群体内各株系间的遗传关系要远，这可能与DH群体的大小有关，也可能与起始材料的遗传组成有关，如果用于小孢子培养的F1代杂种的原始亲本之间的遗传差异大，则小孢子再生植株间的遗传多样性也大。P3由不同来源的父母本杂交而成，其父本Q4606为高株、波浪叶、外叶绿色、心叶黄色，而其母本Q2704为矮生、皱叶、外叶深绿色、心叶红色，两者遗传差异较大，因而其小孢子再生植株间的遗传多样性就大。祝师元[11]利用AFLP分子标记技术对甘蓝型油菜育137 DH群体进行遗传多样性分析发现，该DH群体单株之间的遗传变异相对较小，群体单株之间的相似系数介于0.94～1.0，分析主要原因是小孢子培养来源育137恢复系是一个己经经过多代自交选择的群体，在遗传背景差异上已经较为一致，所以以该材料小孢子培养获得的DH群体单株间的遗传背景差异较小，遗传分离不明显。这说明遗传背景差异越大的材料，其小孢子培养而来的DH群体内各单株间的遗传多样性就越大。

焦德丽等[12]利用SSR标记对甘蓝型油菜DH群体进行了遗传多样性分析，结果表明，通过小孢子培养获得的DH系遗传多样性比较丰富，且不同组合的DH系基因型多样性不同，两个DH群体共62个DH系的遗传相似性范围为0.41～0.92。这表明经小孢子培养所得的DH群体内会出现较大的分离，群体内存在很大的遗传差异。张继红等[13]在分析大白菜DH群体的遗传变异性时也获得了同样的结论。小孢子培养后，经过基因重组可获得遗传上具有多样性的DH群体，为亲本选育提供提供了一个较大的、良好的选择空间，在生产上具较重要的意义。

在聚类图中可以看到DH群体内有些株系间的遗传相似性非常高，如DN35与DN42、DN8与DN9、DN22与DN25、DP25与DP31、DP21与DP34，它们之间的相似系数均在0.9以上，有的甚至接近1.0，其遗传背景基本一致。这也就是说由同一亲本获得的DH群体中可能存在较多遗传背景相似甚至一致的株系。一般而言，DH群体越大，出现重复单株的可能性就越大[14]。因此，在小孢子培养供体亲本选择上，应该增加亲本的来源范围，加大亲本供体数量，而相应减少同一亲本获得的DH群体数量;同时应该将表型选择与分子标记选择相结合，既减少了不必要的重复，又增加了选择的目的性，提高了选择效率，增加了所需要的优良性状株系中选的几率。

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