胱抑素C原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化

唐红卫，刘一凡，孙 禅，端永艳，李 迪，李绵洋，王成彬解放军总医院 临检科，北京 0085；中南大学湘雅医学院 医学检验系，湖南长沙 400；深圳康美天鸿有限公司，北京 008

血清胱抑素(cystatin C，Cys-C)是一种低分子量蛋白质，是由122个氨基酸组成的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，是一种血浆内源性成分，它具有稳定和不受调节的性质，可自由通过肾小球。Grubb等[1]于1985年首先报道其血清Cys-C水平与肾小球滤过率(glomerular filtration rate，GFR)密切相关，可作为肾小球滤过功能的指标，对早期肾病的检测有重要意义。目前常用的检测Cys-C的方法有：单向免疫扩散法(radial immmene diffusion，RID)、酶免疫测定法(enzymeimmunoassay，EIA)、放射免疫法(radioimmunoassay，RIA)、乳胶颗粒增强免疫比浊法(particle enhanced turbidimetric immunoassay，PETIA)、时间分辨荧光免疫法(time resolved fluoroisnmunoassay，TRFIA)、颗粒增强散射免疫比浊法(particle-enhanced nephelometric immunoassay，PENIA)等。而PENIA法因其自动化程度较高，灵敏度可达150 μg/L，远远底低于健康人的下限，而成为临床检测Cys-C的最常用方法[2]。但目前国内常用的胱抑素C监测试剂盒均为进口试剂盒，价格昂贵，影响其在国内的推广应用。本实验利用pET表达系统，在大肠埃希菌中表达Cys-C，并进行纯化，为进一步制备抗体，制备研发测Cys-C试剂盒奠定基础。

材料和方法

1 主要材料 大肠埃希菌Rosetta、载体pET-30a(+)购自上海诺力有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Bioflux公司；载体测序和引物合成均由Invitrogen公司完成；HEK293细胞株购自北京伯乐生命科学发展有限公司；限制性核酸内切酶BamHⅠ和HindⅢ、DNA连接酶、Trizol试剂购自TAKARA公司；AMV逆转录酶购自美国Promega公司；质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、普通DNA产物纯化试剂盒购自天根生化科技有限公司；蛋白Marker购自Fermentas公司；镍离子亲和层析柱(Ni2+-NTA agarose)购自Qiagen公司；羊抗人Cys-C蛋白抗体购自 Santa Cruz公司；兔抗羊IgG及辣根过氧化物酶标记的亲和素均购自北京鼎国生物公司；其他化学试剂均为国产分析纯。

2 寡核苷酸引物设计与合成 遵循PCR引物设计的原则，根据GeneBank(NM-000099.2)报道的Cys-C的cDNA序列，设计编码Cys-C基因片段5'和3'端寡核苷酸引物，并在各自5'末端分别引入BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶位点5'和3'端引物序列：5'端引物，5'-CGGGATCCGGCTCCAGTCCT GGCAAG-3'；3'端引物，5'-CCCAAGCTTTTAGGC GTCCTGACAGGTGGATT-3'，以上引物由Invitrogen公司完成合成。

3 RT-PCR扩增及测序 Trizol法从HEK293细胞株提取mRNA，1%琼脂糖凝胶电泳测RNA纯度，AMV逆转录酶逆转录合成单链cDNA，并以此为模板RT-PCR得到Cys-C基因双链DNA。PCR参数：94 ℃预变性4 min；94 ℃变形40 s；57 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，循环30次；72 ℃终延伸5 min。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并最终获得重组载体pET-30a(+)-CysC体，转化大肠埃希菌Rosetta，经过蛋白筛选，酶切、 PCR鉴定初筛阳性克隆菌株。基因测序由Invitrogen公司完成。

4 Cys-C阳性克隆菌株的诱导表达 阳性克隆菌接种于20 ml LB液体培养基中(含50 mg/L卡那霉素)，37 ℃，200 r/min摇荡过夜。次日取2 ml菌液接种于600 ml液体培养基中(含50 mg/L卡那霉素)，37 ℃，200 r/min培养4 h左右，至OD值A600为0.6 ~ 0.8。添加诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalac-topyranoside，IPTG)(0.1 mm)，16 ℃，100 r/min培养17~18 h。将培养基4 ℃，5 000 r/min离心10 min，收集菌体。取部分菌加入裂解液(pH 8.0 Tris-Hcl 20 mmol/L)，取上清，超生破碎取蛋白，13 000 r/min，10 min。将沉淀物再进行裂解悬浮，超生破碎。分别取上清和沉淀加入5×SDS缓冲液中，SDS-PAGE电泳显示表达的Cys-C多数存在于沉淀中。

5 Cys-C的提取及纯化 诱导600 ml阳性表达菌液，离心收集菌体沉淀，加入Tris-NaCl缓冲液A(20 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，5 mmol/L咪唑，pH=8.0)，超声裂解菌体(冰水混合物，180 W，30 min)。4 ℃、12 500 r/min，取上清，溶液过滤器抽滤，通过AKTA purifier 10/100系统，运用镍柱亲和层析法纯化Cys-C。收集原液、流出液、10%、20%、30%、60%、100%B(20 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，pH = 8.0)洗脱液，SDS-PAGE电泳，得到蛋白纯化图。

6 Cys-C的ELISA评价 微孔板每孔包埋纯化所得Cys-C蛋白1 μg，阴性对照包被HP天然抗原。将羊抗人Cys-C单抗按1∶20 000、1∶40 000、1∶80 000、1∶160 000、1∶320 000、1∶640 000、1∶1 280 000、1∶5 120 000、1∶10 240 000、1∶20 480 000、1∶40 960 000、1∶81 920 000稀释，37 ℃孵育2 h，洗板。加兔抗羊IgG，37 ℃孵育2 h，洗板。加辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的亲和素，37 ℃2 h，充分洗涤后加二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色鉴定表达产物。

7 Cys-C表达量的检测 纯化后洗脱液经SDSPAGE电泳图像分析相对含量。取纯化后Cys-C紫外分光光度计测OD值，计算所得Cys-C浓度为40 μg/ml。

结 果

1 琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性 Trizol法提取的RNA，在进行PCR扩增前预先经1%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和完整性。结果显示RNA有明显的3条带即5S、18S和28S，表明RNA提取成功。由图还可以看出18S和28S条带较亮、5S条带亮度较浅，RNA无明显拖带，说明RNA没被降解，完整性较好。见图1。

2 Cys-C基因表达的测定 PCR扩增结果由图2A可知目的条带＜400 bp，根据引物预期条带的大小为378 bp，扩增与预期结果一致，测序结果显示与GeneBank(NM-000099.2)100%同源。

3 重组载体的菌株的酶切鉴定 选取两个克隆菌株进行酶切鉴定，目的条带及载体条带均与预期一致。下面亮度较弱的条带意味着基因与载体相连接，因较多的Cys-C与载体相结合，所以目的条带亮度较弱。见图2B。

4 Cys-C原核表达SDS-PAGE电泳分析 将含有重组载体pET-30a(+)-CysC的大肠埃希菌Rosetta，经IPTG诱导，进行裂解，超声破碎后SDS-PAGE电泳，见图3。由电泳图可知，未经IPTG诱导的大肠埃希菌未能产生Cys-C；IPTG诱导的大肠埃希菌的上清液和沉淀中均含有较多Cys-C，沉淀中Cys-C较多而纯；Cys-C相当分子质量约为20 000 bp。

5 镍柱亲和层析法纯化目的蛋白 镍柱亲和层析法纯化Cys-C，原液与流出液相比，胱抑素含量明显减低；10%B洗脱可洗掉大部分杂质，且只有小部分胱抑素被洗掉；20%B可得到较多的胱抑素，但仍含有少量杂质；30%B洗脱既可得到较纯净的胱抑素；60%B洗脱所得胱抑素更为纯净，但含量较30%B明显减少。收集30%B、60%B洗脱液进行下一步处理。见图4。

6 Cys-C的ELISA评价 为证实所纯化的蛋白为Cys-C，用羊抗人Cys-C单克隆抗体进行ELISA分析。所纯化蛋白可以与羊抗人Cys-C单克隆抗体特异性结合，从而证明所纯化蛋白为Cys-C。见表1。

表1 ELISA分析结果Tab. 1 ELISA of Cys-C

讨 论

长期以来，血清肌酐、尿素N、尿酸等是反应肾小球滤过率的常用指标。血清尿素氮首先被作为肾功能的评价指标，但其不符合内源性滤过功能的标记物要求，只有当GFR减少到正常值的40%时，尿素氮才开始升高，且易受到内源性和外源性蛋白物质的影响；血清肌酐作为目前国内仍使用的评价肾小球功能的指标，其只有当肾小球滤过功能减小至正常的1/3以上时才会增加，且易受环境因素的影响。因此肌酐、尿素氮都不能作为肾小球功能的理想指标[3]。胱抑素(cystatin C，Cys-C)是半胱氨酸蛋白酶抑制剂蛋白质中的一种，它由管家基因编码，能在所有的有核细胞内以恒定的速度持续转录和表达，无组织特异性，故Cys-C可在体内以恒定速度产生，并存在于各种体液之中，尤以脑脊液和精浆中含量为高，尿液中最低[3]，不受年龄、性别、体重、炎症等因素影响。其分子量小(13 kU)，生理条件下带正电荷，能自由通过肾小球，并可被肾小管上皮细胞完全重吸收，不重新回到血液中[4]；同时肾小管上皮细胞也不分泌Cys-C至管腔内，其在评估肾小球功能方面可以取代传统的GFR检测[5-6]。因此，Cys-C成为反应肾小球滤过率的理想指标[7-12]。

目前检测Cys-C常用的生化检测方法主要是免疫浊度法，其首要条件是Cys-C蛋白抗原的制备与纯化。本实验采用Trizol法从大肠埃希菌Rosetta gamiB(DE3)(DE3)中通过RT-PCR获得mRNA，经琼脂糖凝胶电泳分析知RNA的完整性较好，且没有蛋白污染。大肠埃希菌Rosetta gamiB(DE3)菌株含有trxB和gor双突变基因，能促进二硫键的形成。研究表明，含有双突变基因的菌株比单独含有trxB的菌株更容易促进二硫键的形成，提高重组蛋白的活性[13]。相同的表达水平，gamiB(DE3)菌株所表达的活性蛋白是其他菌株的10倍以上[14]。Rosetta gamiB(DE3)菌株含有T7RNA聚合酶基因，诱导产生的T7RNA聚合酶合成RNA的效率是其他大肠埃希菌聚合酶的许多倍[15]。另外该菌株缺乏外源性蛋白的lon蛋白酶和ompT外膜蛋白酶，可减少纯化过程中外源蛋白的降解。且该菌株还含有lac透性酶突变基因，可使IPTG均一性进入所有细菌中，提高IPTG的诱导效率，增加重组的Cys-C的表达。而且我们比较了其他菌株的诱导结果，发现Rosetta gamiB(DE3)菌株生成包涵体较少，从而有利于重组的Cys-C的获取。载体pET-30a(+)含有5'-his标签/凝血酶/S.Tag/ enterokinase，以及3'-his标签。pET-30a(+)在辅助噬菌体的帮助下可以产生包含克隆基因单个DNA链的粒子，从而在T7终止引物的作用下实现单链转录。另外pET-30a(+)本身含有his标签，可以与金属螯合物(如镍离子等)结合，从而利于重组蛋白的纯化。经PCR、酶切且测序准确获得重组载体pET-30a(+)-CysC，其与genebank(NM-000099.2)所报道的胱抑素C基因系列达到100%的同源性，基因序列的完全同源确保了诱导蛋白的准确性。本实验研究表明，重组的Cys-C主要以可溶性和非可溶性两种形式存在，未经IPTG诱导的大肠埃希菌基本不表达Cys-C。重组Cys-C主要以可溶性蛋白形式存在于大肠埃希菌中，菌体经超声破碎后，得到重组的Cys-C，再经镍柱亲和层析即可得到纯净的Cys-C，NC膜透析，浓缩纯化，制备纯的Cys-C蛋白。电泳分析结果表明，目的蛋白分子质量约为20 000，相对含量约为20%；ELISA结果表明，所得蛋白可与胱抑素单克隆抗体呈特异性反应，表面所得蛋白为Cys-C。

以上实验结果表明，本次构建的胱抑素C表达系统是成功的，从基因的提取、克隆、表达和纯化都比较简单，为今后制备Cys-C抗体，或实验室胱抑素校准品奠定基础。

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