防御素 HBD-2在口腔白斑病损中表达的研究

李维善,朱建华,姜景红

(佳木斯大学附属口腔医院牙周黏膜病科,黑龙江 佳木斯 154002)

口腔白斑病(oral leukoplakia OLK)是口腔黏膜上的白色斑块或斑片,世界卫生组织(W HO)将其归入癌前病变 ,虽然目前其病因不明,白斑发病与局部因素的长期刺激及某些全身因素有关。抗菌肽是广泛存在于自然界的一类生物源性多肽,具有广泛的抗细菌、抗病毒、抗真菌及抗肿瘤等活性,主要存在于人类黏膜组织中的抗菌肽是防御素家族和Cathelicidins家族[1]。人类 β- 防御素 (human β-defensins,hBDs)是防御素家族中的重要成员之一,其中防御素 HBD-2因其具有高效的杀菌活性,同时在口腔上皮天然免疫的作用而备受关注。因此,本研究通过免疫组化方法检测 OLK患者病损中防御素 HBD-2的表达水平,探讨防御素 HBD-2在 OLK致病过程中的作用以及与癌前病变的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

纳入2011～2012年在佳木斯大学附属口腔医院 OLK患者 8例,经病 理科 HE染色确诊 ,其中男 6例 ,女 2例;年龄 47～62岁,病程3个月～2年,病损部位均为颊黏膜,临床上为均质型白斑,8例患者均排除全身系统性疾病,且在前 3个月内均未接受过任何治疗。对照组 6例为正常口腔黏膜组织,来源于本院口腔颌面手术病例,其中男女各3例,年龄 23～61岁。病理组织切片的纳入标准:研究标本固定良好,相应的病理和临床病例齐全。所有研究对象签署知情同意书。切取研究对象的病变部位0.5cm大小,于10%中性甲醛固定液中固定后常规石蜡包埋,4μ m厚超薄连续切片,用于病理诊断及免疫组化染色检测。

1.2 免疫组织化学法(IHC)

鼠抗人 HBD-2单克隆抗体(武汉博士德生物技术有限公司),DAB显色剂(上海科兴商贸有限公司),采用微波修复抗原的 SP法进行免疫组织化学染色半定量检测 HBD-2蛋白的表达。将各组标本切片 ,置烤箱 60℃60min使切片紧密粘附,然后二甲苯脱蜡,梯度水化至水,3%过氧化氢液室温孵育10min,蒸馏水洗3次,微波炉抗原修复,PBS洗涤,血清封闭 ,室温孵育 20min,不洗 ,HBD-2一抗 (1：50稀释 )37℃孵育2h或 4℃过夜,PBS漂洗,生物素标记二抗室温孵育20 min,PBS漂洗,链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物室温孵育 20min,PBS漂洗,DAB显色,苏木素复染,中性树胶封片,显微镜下观察并照相。空白对照片以 PBS代替一抗。以肺泡组织作阳性对照,以细胞深染成个粒状棕黄色为阳性表达。空白对照采用 PBS替代一抗,阳性对照采用已知阳性片。

1.3 图像分析

利用彩色图像分析系统、Image pro-plus 5.1图像分析软件,高倍镜下,每张切片的各个阳性染色的部位随机选取10个视野,测量其平均吸光度值(average optical density,A值),并选取同张切片的空白区进行校正。将校正后的平均值作为该片的 A值。利用 SPSS 13.0统计软件对各组数据进行单因素方差分析。

2 结果

免疫组化染色结果 8例口腔白斑病损中和6例对照组织均出现防御素 HBD-2的阳性染色,阳性染色主要表达在细胞浆内,细胞膜和细胞核未见阳性表达。防御素 HBD-2在对照组和口腔白斑组黏膜组织中的表达情况通过平均吸光度值 A显示,正常组 8.13±0.46,白斑组 12.56±0.37,显示HBD-2在对照组、白斑组中的阳性染色表达逐渐增强;使用单因素方差分析结果显示,与对照组相比较,HBD-2在白斑组表达阳性强度均明显增加 (P＜0.01),图1～ 2。

3 讨论

口腔是一个复杂的环境,栖息着大量的微生物,口腔黏膜上皮长期经受各种微生物的侵袭和一些化学性以及机械性刺激,因此口腔黏膜易发生感染和其它病损。为保护口腔黏膜免受这些有害物质入侵,防止各种口腔黏膜疾病的发生,口腔黏膜组织中各种免疫细胞和一些抗微生物肽等形成一道防御性屏障,其中防御素是这个屏障的重要组成成分[2]。

防御素 HBD-2在1997年首先从牛皮癣患者的皮肤中分离并纯化得到[3],防御素 HBD-2是最早在人体中被发现的体内可诱导性防御素,可以通过炎症等刺激因素诱导其表达增加。防御素 HBD-2广泛分布于口腔颊黏膜、舌黏膜、牙龈等组织,唾液和龈沟液中也有广泛的分布,具有高度的抗菌活性[4]。HBD-2在口腔上皮天然免疫、肿瘤免疫和获得性免疫中均发挥作用[5]。Sawaki等[6]通过免疫组化的方法观察到 OLP、假丝酵母菌性白斑及白假丝酵母菌病的病变组织中HBD-2的表达均有增强。近年来,口腔的恶性肿瘤的发病率不断增加,发病原因复杂,其中感染是肿瘤发病发展的一个重要促进因素,同时肿瘤患者机体免疫功能紊乱,在各种病原体的侵袭下易发生感染,在白斑病损中常伴有白色念珠菌感染,且伴白念感染者癌变率增加,本研究结果显示,与对照组相比较 HBD-2在白斑病损中的阳性染色呈逐步增强趋势,与以往的研究结果一致[7]。防御素 HBD-2是防御素家族的成员之一,参与组成了口腔黏膜的免疫防御体系一部分,在口腔黏膜的免疫防御中发挥作用。防御素 HBD-2在口腔白斑的发生和发展过程中,参与了口腔黏膜和机体的免疫防御反应,提示其可能与口腔癌前病变有某些联系。本研究中白斑患者虽然均已被临床和病理证实,但是癌变率更高的非均质型白斑病例没有收集到,上皮异常增生程度与白斑病损中 HBD-2表达变化否有关,还要进一步深入的研究。

[1]Dale BA, FredericksLP.Antim icrobialpeptides in the oralenvironment:expression and function in health and disease[J].Curr Issues Mol Biol,2005,7(2):119-133

[2]Robert EW Hancock.Peptides antibiotics[J].Lancet,1997,349(9409):418-422

[3]Harder J,Bartels J,Christophers E,et al.A peptide antibiotic from human skin[J].Nature,1997,387(6636):861

[4]Eswarappa SM,Panguluri KK,Hensel M,et al.The yejABEF operon of Salmonella confers resistance to antimicrobial peptides and contributes to its virulence[J].Microbiology,2008,154(2):666-678

[5]肖丽婷,邹杰,陶人川,等.人类β-防御素2在口腔扁平苔藓病损中表达的研究 [J].广西医学,2011,(33)5:516-519

[6]Sawaki K,Mizukawa N,Yamaai T,et al.Immunohistochem-ical study on ex pression of alpha-defensin and beta-defen-sin-2in human buccal epithelia with candidiasis[J].Oral Dis,2002,8(1):37-41

[7]Chunyi Yin,Hoa N Dang,Farzad Gazor,et al.Mouse salivary glands and human β- defensin- 2as a study model for antimicrobilal gene therapy: technical considerations[J]. Int J Antimicrob Agents,2006,28(4):352-360