氧化低密度脂蛋白损伤血管内皮细胞及促血管平滑肌细胞增殖的机制

何玉萍 匡忠生 何玉珊 许翌嘉

(广州中医药大学第一附属医院实验中心，广东 广州 510405)

血管内皮细胞(VEC)是循环血液与血管平滑肌细胞(VSMC)的中介，不仅起到屏障作用，而且还具有活跃的内分泌功能，通过释放生物活性物质参与多种生理及病理过程。动脉粥样硬化(AS)是以VEC和细胞间大量脂质堆积、单核或巨噬细胞浸润、泡沫细胞形成、VSMC增殖为特征〔1〕。VEC的慢性损伤是AS发生的先决条件及重要机制〔2〕。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)可对VEC产生毒性作用，是引起内皮损伤的一个重要的有害因子，是AS形成和发展的关键因素〔3，4〕。本文研究探讨ox-LDL对人血管脐静脉内皮细胞(ECV304)细胞内Ca2+浓度、线粒体膜电位(MMP)、凋亡率以及内皮细胞损伤条件下对VSMC增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞株 ECV304细胞株(中山大学细胞库);VSMC细胞株(广州中医药大学伤寒研究室惠赠)。

1.2 主要试剂与仪器 RPMI1640培养基(美国GIBCO);胎牛血清(美国GIBCO);低密度脂蛋白(LDL，美国SIGMA);噻唑蓝(MTT，AMRESCO产品);钙离子荧光探针(Fluo-3/AM，Bio-Rad产品);Rhodamine123(Rh123，BIOCHEMICALS);碘化丙啶染色液(PI，BECKMAN COULTER公司产品);流式细胞仪(美国BECKMAN COULTER公司 ALTRA型)，四色荧光，配套EXPO32采集分析软件，MultiCycle分析软件。

1.3 ox-LDL的制备 将LDL置于含10μmol/L CuSO4的PBS(pH7.2)溶液中，37℃温育24 h，再将溶液置含200μmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)的PBS中，在4℃中透析24 h，超滤除菌后4℃保存备用。

1.4 ox-LDL对ECV304损伤的影响及条件培养基制备 细胞以5×105个/ml细胞数接种入24孔培养板，待细胞生长至稳定状态(约24 h)，ox-LDL组加入25μg/ml ox-LDL，正常对照组加等量生理盐水，置于37℃、5%CO2、95%空气的培养箱培养24 h后，收集两组培养基(条件培养基)，超滤除菌后，－20℃保存备用。培养板的细胞用PBS轻洗2遍，用2.5 g/L胰蛋白酶和0.2 g/L EDTA-Na2混合液消化，收集单细胞悬液检测指标。

1.4.1 MTT法检测细胞活性 细胞以5×104个/ml细胞数接种入96孔培养板，待细胞生长至稳定状态(约24 h)，ox-LDL组加入25μg/ml ox-LDL，正常对照组加等量生理盐水，置于37℃、5%CO2、95%空气的培养箱培养24 h后，每孔加入10 g/L的MTT 10μl，培养4 h，弃去培养基，每孔加入150μl二甲基亚砜(DMSO)，置微量振荡器上振荡10 min，酶标仪(波长570 nm)测定吸光值(OD)。

1.4.2 细胞内钙离子浓度检测 戊二酰氧甲基脂 (Fluo-3)是一种新型的Ca2+荧光指示剂，能与Ca2+高度特异性地结合，依赖脂溶性乙酰氧甲基(AM)酯化后就容易跨过质膜进入胞质，在胞浆内与游离Ca2+结合。采用FCM测定其平均荧光强度可反映细胞内Ca2+浓度的变化，荧光强度与胞内Ca2+浓度成正比。检测方法:单细胞悬液，加入终浓度为5μmol/L的Fluo-3/AM，在37℃水浴45 min，PBS洗细胞2次，加0.5 ml PBS重悬细胞，FCM检测，用EXPO32采集分析软件分析Ca2+平均荧光强度。

1.4.3 ECV304线粒体膜电位测定〔5〕Rh123是一种阳离子亲脂性荧光染料，对细胞膜具有通透性，由于活细胞线粒体内外膜之间存在着跨膜电位，因而Rh123进入细胞内后能特异地聚集于线粒体，其摄入量与线粒体膜电位成正比，荧光强度变化可反映线粒体膜电位变化。检测方法:单细胞悬液，PBS洗细胞2次，加入终浓度为1μmol/L Rh123，37℃避光孵育30 min后，PBS洗细胞2次，再用PBS重悬细胞，FCM检测并用EXPO32采集分析软件分析其平均荧光强度。

1.4.4 细胞凋亡率检测 收集ECV304单细胞固定于70%冰乙醇中，加盖置4℃冰箱固定24 h后，取固定细胞1 000 r/min离心去除乙醇，加PBS洗涤2次，调整细胞数(1×106)，加入PI荧光染液(含RNase)1 ml避光孵育25 min，进行FCM检测。采集3×104个细胞，采用MultiCycle软件分析细胞凋亡率。

1.5 ox-LDL诱导ECV304损伤培养基对VSMC增殖的影响取VSMC接种于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，24 h后换成无血清的RPMI1640培养基培养48 h使细胞同步化，再换相应的ECV304条件培养基，继续培养24 h，去培养液，PBS洗2次，用2.5 g/L胰蛋白酶和0.2 g/L EDTA-Na2等量混合液消化，收集VSMC单细胞并固定于70%冰乙醇中，加盖置4℃冰箱固定24 h后，1 000 r/min离心去除乙醇，加PBS洗涤2次，调整细胞数(1×106)，加入PI荧光染液1 ml避光孵育25 min，进行FCM检测，采集3×104个细胞，运用MultiCycle软件进行分析VSMC周期各时相DNA百分率(G0/G1、S、G2/M)及增殖指数〔增殖指数=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%〕。

1.6 统计学处理 采用SPSS16.0软件进行统计学处理。

2 结果

2.1 ox-LDL损伤ECV304 ox-LDL致ECV304细胞损伤，诱导细胞凋亡，表现在细胞活力降低，Ca2+超载，MMP下降，细胞凋亡率明显增高，与正常组比较有非常显著差异(P＜0.01，P＜0.001)。见表1。

2.2 ECV304损伤培养基对VSMC增殖影响 ECV304损伤培养基使VSMC处于G0/G1期的细胞百分明显减少，S期和G2/M期的细胞明显增多，增殖指数增高，与正常组比较有非常显著差异(P＜0.01，P ＜0.001)。见表2。

表1 ox-LDL致人脐静脉血管内皮细胞损伤(x ± s，n=10)

表2 ox-LDL诱导VEC损伤条件培养基促VSMC增殖的影响(x ± s，n=10)

3 讨论

AS常见于中老年人，其发病机制至今尚未完全阐明，目前许多学者已从细胞生物学和分子生物学方面对AS的发病机理进行大量研究，提出VEC功能损伤是AS发生的始动因素，VSMC 增殖在 AS 病理过程发挥重要作用〔2，6，7〕。Ca2+作为信号传导系统中的第二信使，在传递细胞信息、调控各种细胞效应和维持细胞正常生理功能等过程中起重要作用。Ca2+超载，可导致细胞损伤及死亡〔8〕。线粒体是细胞能量代谢场所，参与细胞凋亡的重要细胞器。MMP是线粒体功能的重要参数，是评价线粒体功能的敏感指标，它的大小直接反映线粒体功能及数量〔9〕。研究表明，细胞凋亡的最早期阶段在细胞核病理改变出现前MMP就已下降，MMP降低是细胞凋亡不可逆转的标志〔10〕。研究发现，VEC凋亡可引发血管调节功能失衡，促进VSMC的增殖、迁移〔11〕。

ox-LDL具有的细胞毒性和自由基作用，是内皮细胞较为敏感的一种刺激因子，对VEC产生毒性作用，而且还通过多个信号传导通路改变内皮细胞分泌活性，导致内皮细胞功能失调，造成VEC损伤，促使VSMC增殖和内膜异常增生，降低内源性抗AS的机制〔3，4，12〕。本实验通过 ox-LDL 对 ECV304 细胞 Ca2+浓度、MMP以及细胞凋亡率的影响，探讨ox-LDL致VEC损伤机制，结果表明ox-LDL导致VEC损伤，引起细胞内游离Ca2+浓度升高，致的线粒体功能障碍，促进细胞凋亡;并且改变内皮细胞分泌活性，引发血管调节功能失衡，其损伤的培养液促进VSMC增殖、迁移，可能是最终导致AS的发生发展机制之一。

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