清开灵注射液对小鼠TB细胞增殖与功能的影响*

邢恩鸿，邵雪斋，张 丽，王 睿，王旭丹

(1.承德医学院附属医院，河北 承德 067000 2.北京中医药大学免疫学教研室，北京 100029 3.北京理工大学，北京 100081)

清开灵是在“安宫牛黄丸”的基础上研制成的一种纯中药制剂。在临床上主要用于治疗感染性疾病、脑血管疾病、传染性疾病［1－3］，近年来在治疗急慢性肝炎、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病方面，均取得良好疗效［4，5］。在治疗机理基础研究方面，主要集中于脑血管疾病、感染、发热性疾病等方面，对清开灵免疫调节作用机制的研究相对滞后［6－8］。本文旨在初步探讨清开灵体内对小鼠T、B细胞增殖与功能的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂：试剂：清开灵注射液由北京中医药大学药厂生产，人平均用药量20－40mL/d(0.67mL.kg－1.d－1)，小鼠用药量定为3.35、6.70、13.33mL/kg/d 3个剂量组，分别相当于临床人用药量的5、10、20倍，实验时用无菌生理盐水配制成所需剂量;地塞米松磷酸钠注射液(阳性药)：由广州光明制药厂提供，含药量2mg/mL。人平均用药量5mg/d(0.083mg·kg－1.d－1)，小鼠用药量定为大剂量1.66mg.kg－1.d－1，相当于临床人用药量的20倍，实验时用无菌生理盐水配制成所需剂量;LPS、ConA、甲基偶氮唑盐(MTT)均为美国Sigma产品;RPMI－1640培养液为美国Gibco产品;二硝基氟苯由北京化学试剂公司生产。动物：Babl/c小鼠，雌性，体重18－20g，购于北京维通利华实验动物中心，清洁级。仪器：550型酶标仪(美国伯乐)。

1.2 动物分组与给药

1.2.1 分组：将60只Balb/c小鼠采用抽签法随机分为6组，分别为正常对照组、DTH对照组、清开灵注射液低、中、高三个剂量组及地塞米松磷酸钠阳性对照组，每组10只，逐只标记。

1.2.2 给药：清开灵三剂量组及阳性药组分别腹腔注射(i.p)给予相应的药物，每日一次，连续10d;正常对照组及DTH对照组腹腔注射等量的无菌生理盐水。

1.3 实验方法与检测指标

1.3.1 清开灵注射液对正常Balb/c小鼠免疫器官指数的影响：实验结束时按编号顺序称重，摘眼球取血处死小鼠，无菌摘取脾脏、胸腺，称湿重(mg)，按下列公式计算免疫器官指数：胸腺指数=胸腺重量(mg)/体重(g)，脾脏指数=脾脏重量(mg)/体重(g)。

1.3.2 清开灵注射液对正常小鼠DTH反应的影响：所有动物均在给药d5腹部剃毛(3cm×3cm)后，均匀滴涂50μL配制好的致敏液(1%的DNFB溶于1：1的丙酮/色拉油中)致敏。给药d9除正常对照组外，其余各组动物于右侧耳部内侧涂1%的DNFB10μL攻击，诱发DTH反应，d11眼球放血处死小鼠，剪下小鼠两耳，在耳的同一部位打孔(直径为7mm)，天平上称其重量，以左右耳片重量差作为DTH反应的强度指标。

1.3.3 清开灵注射液对正常小鼠脾脏T、B淋巴细胞增殖能力的影响：将无菌摘取的脾脏，置于不完全1640培养液中，用50目钢网研磨制成单个细胞悬液，1500rpm×5min离心，弃上清。脾脏细胞悬液用双蒸水(低渗法)破坏红细胞，双盐水恢复等渗后，200目尼龙网过滤，1500rpm×5min离心弃去上清。细胞悬液用完全1640培养液调浓度为5×106/mL，加到96孔板中，每组设8个复孔，100μL/孔，用含不同刺激物的1640完全培养液补足至200μL/孔(ConA刺激T细胞增殖，其终浓度为5μg/mL，LPS刺激B细胞增殖，其终浓度为50μg/mL)。将培养板放入37℃、5%的CO2培养箱中，培养至72h。培养结束前4h每孔加入MTT溶液20μL继续培养。培养结束后培养板3000rpm×5min离心，弃去上清，轻扣培养板，用滤纸吸去水分后，每孔加入酸化异丙醇100μL，静置15min，轻轻混匀后，492nm波长测OD值。

2 结果

2.1 清开灵注射液对正常Balb/c小鼠免疫器官的影响：用药后d11时，处死小鼠，测定胸腺及脾脏指数。

2.1.1 胸腺指数：清开灵注射液大、中两个剂量组及地塞米松组均明显低于正常对照组，存在极显著性差异(P＜0.01);小剂量组胸腺指数虽有减小趋势但无统计学意义。见表1。

表1 清开灵注射液对正常小鼠胸腺指数及脾指数的影响(±s)

表1 清开灵注射液对正常小鼠胸腺指数及脾指数的影响(±s)

注：与正常对照组比较：*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别 动物数 胸腺指数(mg/g)脾指数(mg/g)正常对照组 10 2.61±0.47 4.87±0.57清开灵小剂量组 10 2.34±0.40 4.92±0.63清开灵中剂量组 10 2.02±0.33＊＊ 5.34±0.28清开灵大剂量组 10 0.69±0.25＊＊ 5.40±0.63地塞米松组 10 0.69±0.25＊＊2.53±0.20＊＊

2.1.2 脾脏指数：清开灵注射液三个剂量组与正常对照组相比差异均不显著;地塞米松组脾脏指数与正常对照组相比则显著降低，存在极显著性差异(P＜0.01)。见表2。

2.2 清开灵注射液对正常小鼠DTH反应的影响：小鼠经致敏液致敏及攻击后DTH反应十分强烈，攻击侧耳肿胀非常明显，DTH组与正常对照组相比，差异极显著(P＜0.001);三个剂量的清开灵注射液均能明显抑制其DTH反应，与DTH组相比，差异显著(P＜0.05);地塞米松组对小鼠DTH反应的抑制作用最为明显(P＜0.01)。详见表2。

表2 清开灵注射液对小鼠DTH反应的抑制作用(±s)

表2 清开灵注射液对小鼠DTH反应的抑制作用(±s)

注：与正常对照组比较：*P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001;与DTH组比较：△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001

组别 动物数 耳肿胀差值(μg)正常对照组 10 －0.40±1.43△△△DTH对照组 10 55.70±18.73＊＊＊清开灵小剂量组 10 29.44±10.60＊＊＊△清开灵中剂量组 10 32.00±10.22＊＊△清开灵大剂量组 10 27.64±13.89＊＊＊△地塞米松组 10 18.45±9.20＊＊＊△△

2.3 清开灵注射液对正常小鼠脾脏T、B淋巴细胞增殖能力的影响

2.3.1 对脾脏T淋巴细胞增殖能力的影响：清开灵注射液三个剂量组均可明显降低正常小鼠由ConA刺激的T细胞非特异性增殖反应，其中以大剂量组作用最为明显，和正常组相比，差异极显著(P＜0.001)。地塞米松组同样表现了强烈的抑制作用(P＜0.001)。见表3。

2.3.2 对脾脏B淋巴细胞增殖能力的影响：清开灵注射液三个剂量组与正常组相比，均无显著性差异;地塞米松组与正常组相比则表现出显著的抑制作用(P＜0.05)。见表3。

表3 清开灵注射液对正常小鼠脾脏T、B淋巴细胞增殖能力的影响(±s)

表3 清开灵注射液对正常小鼠脾脏T、B淋巴细胞增殖能力的影响(±s)

注：与正常对照组比较：*P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001

组别 动物数 脾脏T细胞OD值脾脏B细胞OD值正常对照组 10 0.671±0.049 0.206±0.035清开灵小剂量组 10 0.534±0.050＊＊＊ 0.223±0.052清开灵中剂量组 10 0.390±0.053＊＊＊ 0.234±0.041清开灵大剂量组 10 0.252±0.019＊＊＊ 0.242±0.037地塞米松组 10 0.242±0.037＊＊＊0.160±0.022*

3 讨论

T细胞来源于骨髓，在胸腺内发育成熟，随后移行至脾等外周淋巴器官及组织，执行特异性细胞免疫应答，并在TD－Ag诱导的体液免疫应答中发挥重要作用。DTH反应是由效应T细胞与相应抗原作用后，引起的以单个核细胞浸润和组织损伤为主要特征的炎症反应，反映机体的细胞免疫状态［9］。

本实验结果表明清开灵对胸腺指数有明显的减小作用。胸腺作为中枢淋巴器官是T细胞分化发育的场所，胸腺指数的异常减小可能影响T细胞的分化及发育，造成成熟T细胞的数量减少及功能受损。

T细胞功能检查发现，清开灵三个剂量组均能抑制小鼠的DTH反应。表明清开灵可抑制由DNFB诱发的正常小鼠的T细胞特异性的增殖反应。与赵令斋等的实验结果相一致［9］。清开灵还可强烈抑制ConA刺激的脾T淋巴细胞的增殖反应。提示清开灵也可抑制正常小鼠的T细胞非特异的增殖反应。

B细胞是除T细胞外机体执行适应性免疫应答的主要免疫细胞。B细胞不仅能通过产生抗体发挥特异性体液免疫功能，也是重要的抗原提呈细胞。本研究结果表明清开灵对正常小鼠的脾指数无明显影响，清开灵对由丝裂原的非特异刺激所引发的正常小鼠B细胞增殖反应亦无明显影响。说明清开灵在体内对正常小鼠的B细胞并无显著影响。

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［5］ 李冬华，清开灵联合葡醛酸钠治疗病毒性乙型肝炎的临床研究［J］.今日药学，2012，22(1)：41－42.

［6］ 庞春红，李澎涛，朱晓磊.缺血－再灌注相关细胞因子表达的TNF－α损伤机制及清开灵的作用［J］.世界中医药，2011，6(4)：343－346.

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