糖尿病肾病肾纤维化病变的发病机制研究进展1）

罗 羽，王仙园，杨云青

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一种严重影响人类健康的内分泌代谢性疾病。近年该病的发病率和致死率在世界范围持续上升，2003年全球约有糖尿病病人1.94亿人，预计2030年将达到3.66亿人；1980年我国糖尿病发病率为0.61%，2010年发病率已高达9.7%，目前糖尿病人数近1亿人，已成为全球糖尿病发病率增长最快、病人数量最多的国家［1］。糖尿病并发症由罹患糖尿病发展而来，包括糖尿病足、糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）、糖尿病视网膜病变、糖尿病性脑病、糖尿病性心血管病、糖尿病皮肤病等多种类型，资料显示，患病3年及5年以上的糖尿病病人出现并发症的几率分别大于46%和61%，病程超过10年者并发症发生率更是高达98%，是导致75%以上糖尿病病人死亡的主要原因。DN是最严重和最常见的糖尿病并发症，从初期出现蛋白尿发展到肾性高血压、肾病综合征，最终引发肾衰竭甚至死亡的时间较短，其3年生存率仅50%左右。由于我国现阶段糖尿病病人从无并发症到出现并发症的年数正不断缩短，DN已成为临床慢性肾衰竭的最主要原发病，由此带来的巨大医疗资源耗费也给个人、家庭和社会造成巨大的经济负担和挑战［2，3］，对DN的发病和预防机制的研究迫切而意义重大。

1 多元醇糖代谢支路、醛糖还原酶的激活与DN肾纤维化的发生发展

多元醇糖代谢途径是人体除糖酵解－三羧酸循环和戊糖磷酸途径之外人体进行葡萄糖代谢的另一支路。多元醇糖代谢支路由两步生化反应组成，醛糖还原酶（aldose reductase，AR）是组成多元醇糖代谢支路的两个酶中的第一个，也是该糖代谢途径的限速酶，主要负责以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（还原型辅酶Ⅱ，NADPH）为辅助因子、还原葡萄糖为山梨醇；在第二步生化反应中，山梨醇脱氢酶（SDH）利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（辅酶Ⅰ，NAD＋）将山梨醇氧化为果糖。

正常生理情况下人体仅有约3%的葡萄糖经该支路代谢，并最终加入到上述两个主要葡萄糖代谢途径［4］。但最近有研究发现，高糖条件下经多元醇糖代谢途径代谢的葡萄糖量大幅增加［5］，提示该代谢支路的异常激活可能是某些特定病理生理变化的重要原因。多元醇糖代谢支路的过度激活及该代谢支路的限速酶和第一个催化酶——AR表达水平与活性的异常升高目前被认为是包括DN在内的糖尿病并发症发生的主要致病机制之一［6］，AR在糖尿病神经病变、糖尿病心血管病和糖尿病视网膜病等多种糖尿病并发症发病机制中的作用已得到充分肯定［7］。

有研究证明，AR在正常情况下的肾内髓层、肾小球中均有高度表达；而在糖尿病状况下大鼠肾小球中的AR表达大幅度升高［8］，继而导致肾小球山梨醇浓度剧增到原有水平的4倍～10倍；在接受了AR化学酶抑制剂（ARI）处理的糖尿病大鼠对照组中，其肾小球山梨醇的浓度却无明显变化；另外，临床病例中也有DN病人的血细胞、神经及肾组织中AR显著高表达的报道［9－11］，并且以带有AR的Z－2／X易感位点的DN病人组中升高幅度最大［9］；进一步应用ARI阻断多元醇糖代谢支路则能明显改善DN大鼠模型有关肾功能的多个参数［12－16］。许多文献报道表明，ARI处理对DN的改善可能确有一定帮助［17，18］；最近的研究也进一步证明，AR的遗传性缺失能抑制高糖引起的转化生长因子－β（transforming growth factor－β，TGF－β）／Smad（signaling effectors mothers against decapentaplegic protein，Smad）信号转导通路的上游信号即蛋白激酶C［protein kinase C／TGF－β（PKC／TGF－β）］的表达上调和活化，进而显著减缓C57BL／6小鼠肾纤维化和DN的进程［19］。这些研究结果显示，AR可能通过调控TGF－β通路的上游或下游信号因子，进而影响DN肾皮质纤维化发生与发展以及DN的进程。

应用各种基因筛选方法对DN病人进行基因多态性检测发现，AR除调控TGF－β外，还可能与血管紧张素转换酶、血管紧张素元、转脂蛋白、肝脏细胞核因子、白细胞介素受体I拮抗物、血浆舒缓素、基质金属蛋白酶、胶原蛋白、心钠素、G蛋白亚单位、血管紧张素系统、血管紧张素Ⅱ受体、内皮素A受体、β2肾上腺素能受体等因子相互作用，通过多生化途径与糖尿病病人高血糖危险因素共同引发其细胞、组织结构与功能改变，参与到DN的发生发展过程。

2 TGF－β／Smad信号转导途径的异常激活可能是DN肾脏炎症和肾纤维化病变的主要机制

肾小球基底膜增厚、系膜基质增多以及纤维素样渗出和沉积、肾小管硬化、肾间质纤维化是DN的主要病理表现，目前TGF－β信号转导通路的异常激活也已被证实可能是DN肾脏炎症和纤维化的主要机制［20，21］。

TGF－β与胰岛素样生长因子（insulin－like growth factor，IGF）、神经生长因子（nerve growth factor，NGF）、血小板衍化生长因子（platelet－derived growth factor，PDGF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等多种生长因子一样，可通过自分泌、旁分泌和内分泌等方式在癌症、纤维化疾病、自免疫疾病及心血管系统疾病等多疾病的发生发展和转归中起着重要作用。TGF－β家族被分为TGF－β1～TGF－β5 5个亚型，哺乳动物体内主要存在TGF－β1～TGF－β33个亚型，其中以TGF－β1占大多数。TGF－β1被认为是介导肾小球硬化和肾间质纤维化关键的细胞因子，其作用包括趋化和活化炎性细胞、介导肾小管上皮细胞向间充质细胞转变分化、刺激细胞外基质蛋白的合成、降低基质金属蛋白酶的活性和（或）增加蛋白酶抑制剂的合成以促进细胞外基质的沉积等。

Smad蛋白家族是TGF－β超家族在细胞内进行信号转导过程中最重要的下游蛋白和效应分子，在将TGF－β信号从细胞表面受体传导至细胞核的过程中起到关键作用。Smad蛋白家族至少包括9种已知的Smad蛋白，分别用Smad 1～9表示，根据其不同的作用和功能Smad蛋白家族又被分为3个亚族，即受体活化型Smad（R－Smads）、共同通路型Smad（Co－Smads）和抑制型Smad（I－Smads）。其中，能由TGF－β激活的受体活化型R－Smads主要包括Smad 2和Smad 3；Co－Smads主要是指在TGF－β家族各类信号传导过程中共同需要的介质Smad 4；抑制型I－Smads包括可与激活的I型受体结合的Smad 6和Smad 7，起着抑制或调节TGF－β家族信号转导的作用。近年研究已证实，TGF－β／Smad信号转导通路参与了人胚胎发育、间质纤维化、肿瘤发生发展和炎症修复等病理生理过程［20，21］，在DN肾纤维化病变过程中也扮演了重要角色，已成为研究热点。

3 miRNAs可通过影响TGF－β信号转导途径调控DN的肾纤维化病变进程

最近有研究表明，有多种miRNAs可能参与了肾细胞和组织中的TGF－β信号转导途径［22－27］，这些miRNAs包括miR－192、miR－200 家 族 miRNAs、miR－21［28，29］、miR－29［20，30］、miR－216［31，32］、miR－93［33］、miR－377［24］、miR－744［34］等，其中以对miR－192和miR－200家族miRNAs的研究较集中。

2007年，Kato等［35］报 道 由 链 脲 佐 菌 素 （streptozotocin，STZ）诱导的1型糖尿病小鼠和2型糖尿病db／db小鼠的肾小球中miR－192的表达水平均有显著增加；miR－192的表达水平在法尼醇X受体（famesoid X receptor，FXR）敲除的糖尿病小鼠［36］以及罹患IgA 肾病［37］和高血压肾脏硬化［38］的病人中也有显著上升；他们随即还发现，在小鼠肾小球系膜细胞中miR－192可以抑制Zeb2（zinc finger E－box binding homeobox－2，亦称Smad－interacting protein－1，SIP1）的蛋白表达，而Zeb1／Zeb2可通过与胶原蛋白1a2（Col1a2）基因上的E－box的相互作用对其进行转录抑制；TGF－β1可刺激miR－192的表达并诱导胶原蛋白合成。Kato等［35］的研究显示，在1型和2型糖尿病动物的系膜细胞中，TGF－β能刺激miR－192的上调，后者继而促进miR－200b／c的表达；miR－200b／c可通过抑制Zeb1以促进Col1a2／Col4a1以及TGF－β的表达，最终造成基质的积聚，DN的典型病理改变发生。近期另有miR－192在纤维化肾脏中的上调与TGF－β／Smad信号转导密切相关的研究报道：在大鼠阻塞性肾病模型中，Smad 7的敲除能促进miR－192的表达并能加强Smad信号转导；在5／6肾切除模型中，Smad 7的过表达能抑制miR－192的表达和肾纤维化；而在体外培养细胞中，Smad 3通过结合到miR－192启动子区促进了TGF－β诱导的miR－192的表达，而Smad 2却未发现有此效应；同时，过表达或抑制miR－192也对胶原蛋白基质的生成有显著影响。这些结果表明，miR－192可能是TGF－β／Smad 3信号转导途径介导肾纤维化过程中的一个下游调控因子［25］。但与此相反，英国Cardiff大学Donald Fraser教授课题组却报道，慢性DN病人的肾组织中miR－192的表达非但没有上升反而明显下调，且病程越长者肾组织中miR－192的表达越低［39］；同时，低表达的miR－192与低肾小球滤过速率（GFR）和肾小管间质纤维化有相关性；该实验小组还发现在体外培养近端小管上皮细胞（proximal tubular epithelial cells，PTEC）中，TGF－β1的处理能抑制miR－192的表达，miR－192的过表达则能抑制Zeb1和Zeb2的表达并进而抑制TGF－β引起的上皮－钙黏蛋白（E－cadherin）的下调。综合上述研究结果，该研究小组认为在PTEC中，TGF－β能抑制miR－192的表达，而miR－192的下调可能通过促进TGF－β引起的E－cadherin的下调而加剧肾纤维化程度和肾小球滤过功能的丧失。澳大利亚Phillip Kantharidis教授课题组的研究发现，在原代培养大鼠系膜细胞和PTEC细胞中，TGF－β能抑制miR－192的表达［40］；在载脂蛋白E基因敲除小鼠的肾皮质中，miR－192／215的表达水平在糖尿病出现10周后即开始显著下调，同时还伴随有Zeb2mRNA水平的显著升高。

在Kato等［35］的研究中，发现db／db小鼠肾小球的 miR－192水平是db／＋对照小鼠2倍时所采用的小鼠处10周龄大小；而英国Cardiff大学Donald Fraiser教授课题组、澳大利亚Phillip Kantharidis教授课题组采取的实验小鼠是25周龄左右，这说明miR－192在糖尿病小鼠肾中的表达极可能具有一定时间依赖性，即可能与实验小鼠罹患糖尿病的病程密切相关［41，42］。而且实验动物模型的年龄、病程还可能仅是导致研究差异的部分原因，实验对象、实验条件、细胞类型、糖尿病类型和实验动物接受实验时所处的糖尿病发展阶段等众多因素均可能是造成研究结果截然不同的原因，显然miR－192／215与TGF－β／Smads、Zeb1／Zeb2等组成的调控网络十分复杂。

miR－200家族（亦称miR－8家族）miRNAs包括miR－200a、miR－200b、miR－200c、miR－141、miR－429。研究显示，它们在发育中的前肾、皮肤和一些体节均有表达，是成熟肾组织中含量最高的miRNAs，很可能在肾脏发育中扮演重要角色。最新研究表明，miR－200家族miRNAs可通过调控E－box基因Zeb1、Zeb2和Snail的表达。Zeb1和Zeb2是E－cadherin的转录抑制蛋白，参与影响上皮－间质细胞转换（epithelial－mesenchymal transition，EMT）的调控，而Snail可以调控肾小管上皮细胞的分化，由此可见miR－200家族在肾细胞分化和组织发育过程中的重要性。

miR－200s家族成员包括 miR－200a、miR－200b、miR－200c、miR－141及 miR－429。在人和小鼠中，miR－200b／200a／429形成一个基因簇，定位在人1号染色体和小鼠4号染色体上；miR－200c／miR141形成另一个基因簇，分别定位于人12号染色体和小鼠6号染色体上。研究发现，miR－200s可与TGF－β、Zeb1／Zeb2形成信号转导网络，调控上皮－间质细胞转化并在肿瘤的发生发展进程中发挥重要作用［43，44］。与miR－192类似、miR－200s在多种肾脏疾病状况下的表达也有显著变化［37］，在大鼠肾PTEC细胞（NRK52E）中，TGF－β1和TGF－β2均能抑制 miR－200s的表达［45］；而 miR－200a能降低Smad3的活性、并抑制TGF－β诱导的胞外细胞基质蛋白的合成，减轻由TGF－β引起的上皮－间质细胞转化。更有意思的是，还有研究表明miR－200a／141可通过与TGF－β2－3’UTR的相互作用，对TGF－β2进行转录后基因沉默，而TGF－β2则可以调控TGF－β1和PAI－1的表达。与非糖尿病对照小鼠相比，糖尿病载脂蛋白E基因敲除小鼠肾脏miR－200a／141的表达显著下调，而 TGF－β1／2、aSMA、Fibronectin、Col4的表达却又显著上调。这些结果说明，miR－200a／141可能能直接或间接调控TGF－β1／2以影响肾纤维化病变的进程，进而在糖尿病肾病的发病中起重要作用。

对糖尿病肾病及发病机制的研究伴随生命科学学科领域的研究手段和研究思路的更新而拓展，对该病的认识处于不断深刻的过程中，生命科学领域一些最新基础研究进展能为临床医学积极治疗和预防糖尿病及并发症提供理论指导和依据，转化医学的内涵也由此得以展现。

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