中药代谢化学研究方法

张 岩，丁振铎，丁晶鑫，王 迪，李文兰

(1.哈尔滨商业大学 生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨 150076;2.国家教育部 抗肿瘤天然药物工程研究中心，哈尔滨 150076;3.黑龙江生态工程职业学院，哈尔滨 150025)

我国自1963年起开始有中草药的代谢研究报道，1980年以来，中药代谢及其药代动力学研究的深度有了大幅度的提高，但对中药成分代谢化学的研究才逐渐得到重视.在此之前，我国研究者所进行的代谢研究主要集中在药物代谢动力学方面［1］.随着药物分析技术、临床药理学和药物动力学的发展，中药的药物代谢也逐渐开展起来，对许多中药单体成分及复方有效成分已相当明确，且中药代谢化学的研究方法也越来越全面，有助于更好的了解其在体内的代谢转化过程，确定其在体内代谢产物的化学结构、药理活性等，从而进一步了解此单体成分进入体内后的药物作用机制，是研制开发新药的重要途径之一.

目前中药代谢研究方法主要有体内和体外两种.体内代谢研究方法是指在动物或人给药后，经过一段时间后收集血、尿、粪、胆汁等生物样品(动物还可获得组织器官等样品)，然后通过气相色谱、高效液相色谱、质谱等技术分析、分离样品中的中药原型及其代谢产物.此方法可对中药的体内影响充分的整合，能全面的反应中药代谢的体内整体特征.但体内代谢方法难度较大，许多中药及其代谢产物在体内的浓度都低，代谢物检测较难.而体外代谢则可在短时间内获得大量的代谢物，可在较短时间内获得明确的结果.肝脏是药物代谢的主要器官之一，富含大量的肝药酶，药物的体外代谢多以肝脏为基础，常见的方法有:肝微粒体体外温孵法、肝细胞体外温孵法、离体肝灌流法、肝切片法和重组P450 酶体外温孵法等.除肝脏外，口服药物还必须经过胃肠道消化吸收后才能入血发挥药效，如人参皂苷Rg1 的体内代谢［2］.现就中药体内、体外两种代谢研究方法作一综述，为中药代谢化学的研究提供思路.

1 中药体内代谢研究方法

1.1 中药在血中的代谢物研究

灌胃给药后，经肝门静脉、腹主动脉或眼眶取血，血液在3 000 r/min 条件下离心10 min，取上清液即得含药血清.根据实验内容考察6%高氯酸沉淀蛋白、甲醇沉淀蛋白、乙酸乙脂萃取、SPE 固相萃取等血清样品预处理方法，筛选出最佳处理方法，并以此法来处理制备好的含药血清，经HPLC、UPLC 等方法来检测分析血液中的代谢成分.如:钱隽等人采用电喷雾串联质谱(ESI－MSn)法研究紫杉醇在人血浆中的主要代谢物.紫杉醇对照品溶液经质谱进样，探索其一级质谱的电离规律和二级质谱的裂解规律，过液相色谱一质谱联用技术分离和鉴定紫杉醇在人体中的代谢物.溶液中的添加剂对紫杉醇的离子化效率有明显促进作用，在ESI 正离子模式下紫杉醇以m/z 854 的［M+H］+丰度最高.紫杉醇裂解过程以脱水和酯键断裂为主，产生多个碎片离子，其中m/z286 信号最强并具有较好的稳定性.确定紫杉醇在人血浆中的代谢物有3个，以6a－羟基紫杉醇为主［3］.李文兰等采用HPLC－ESI/MSn 方法金匮肾气丸总苷灌胃给药后血浆中代谢产物.共鉴定出17个化学成分，8个原型化合物，9个代谢产物，分别为没食子酸，2－羟基苯乙酮－4－O－葡萄糖醛酸酯，芍药苷代谢素Ⅰ，2－羟基－4－甲氧基苯乙酮－5－O－硫酸酯，2，4－二羟基苯乙酮－5－O－硫酸酯，2，4－二羟基苯乙酮和3个未知成分［4］.

1.2 中药在尿中的代谢物研究

代谢产物也可能具有药物活性，能在尿液中检测出来.由于缺乏蛋白质及较高的药物浓度，在中药物质基础研究中尿液样本比血液样本更为有效［5－8］.将实验动物置于代谢笼内适应2d 后，灌胃给药，收集24 h 内不同时间段的尿液，置－20 ℃冰箱中冷冻保存备用.根据实验需要考察正丁醇萃取法、乙酸乙酯萃取法、SPE 小柱固相萃取法等尿液处理方法，筛选出最佳尿液处理方法，并选定此法来处理尿液，经HPLC、UPLC、HPLC－MS 等方法分析尿液中化学成分.如:李文兰等采用HPLC－ESI/MSn 技术鉴定金匮肾气丸总苷在大鼠尿中的代谢产物.在灌胃尿液中共检测出18个化学成分，其中9个原型化合物，9个代谢产物，分别为为没食子酸，脱水莫诺苷元，2－羟基苯乙酮－4－O－葡萄糖醛酸酯，芍药苷代谢素，1－O－甲基，3－羟基马钱苷元，马钱苷元，2－羟基－4－甲氧基苯乙酮－5－O－硫酸酯，2，4－二羟基苯乙酮和1个未知成分［9］.贾元威等对豆腐果苷在大鼠体内代谢进行了初步研究，灌胃给药后收集12 h 内的尿液样本，采用LC－ESI－MS 法进行Ⅰ相代谢物研究，初步鉴定出可能的Ⅰ相代谢物为豆腐果苷苷元(对羟基苯甲醛)、豆腐果苷苷元醛基上的氧化产物(对羧基苯－O－β－D－吡喃阿洛糖苷)及还原产物(对羟甲基苯－O－β－D－吡喃阿洛糖苷).应用酶水解法对其进行Ⅱ相代谢物研究，结果表明大鼠尿液中存在豆腐果苷的葡萄糖醛酸结合物，同时未发现存在豆腐果苷硫酸结合物［10］.

1.3 中药在粪中的代谢物研究

将实验动物置于代谢笼内适应2d 后，灌胃给药，收集24 h 内不同时间段的粪便，置－20 ℃冰箱中冷冻保存备用.根据实验需求粪便样品处理的进行方法学考察甲醇提取法、乙酸乙酯提取法、正丁醇提取法、甲醇－乙酸乙酯提取法.筛选出最佳处理方法，依此处理收集的粪样，经UPLC、HPLC、HPLC－MS 等方法分析粪便中的化学成分.如:陈怀侠等应用电喷雾串联质谱法检测大鼠粪便样中的樟柳碱及其代谢物.收集灌胃20 mg 樟柳碱的大鼠粪样，用水浸泡后，以乙酸乙酯萃取，采用甲醇－0.01%三乙胺水溶液(以甲酸调节pH 3.5)(60∶40)为流动相，0.2 mL/min 流速，40 ℃柱温，以及离子源喷射电压5.0 kV，毛细管电压45 V，毛细管温度200 ℃，鞘气(N2)流速40个单位等进行LC－MS 及LC－MSn 检测原药及其代谢物.和空白粪样及樟柳碱相比较，根据代谢物相对分子质量的变化(ΔMr)及其多级质谱数据，鉴定并阐述其结构.可得樟柳碱在大鼠体内的主要代谢途径有水解、N－去甲基化、苯环羟基化［11］.李文兰等采用HPLC－ESI/MSn 技术鉴定金匮肾气丸总苷在大鼠粪中的代谢产物.在灌胃粪样中共检测出20个化学成分，其中12个原型化合物，8个代谢产物，分别为为没食子酸，獐芽菜苷代谢素A，芍药苷代谢素Ⅰ，1－O－甲基，3－羟基马钱苷元，还原型莫诺苷元，马钱苷元和2个未知成分［9］.

1.4 中药在胆汁中的代谢物研究

实验动物注射一定剂量的麻醉药，进行胆管插管，收集胆汁，在收集的胆汁中加入实验对照品溶液，加乙酸乙酯萃取，10 000 r/min 离心1 min，重复操作3 次，合并上清液，吹干后甲醇复溶涡旋1 min，取上清液备用.经HPLC、LC－MS/MS 检测分析胆汁中的化学成分.如:牟昀雅等采用HPLC－MS/MS 法分离鉴定罗通定在大鼠胆汁中的代谢产物.灌胃给药后收集大鼠胆汁，液液萃取，采用甲醇－水－三乙胺(30∶70∶0.07，V/V/V)，冰醋酸调节pH 至6.3，流速0.01 mL/min，10 μL 进样量，40 ℃柱温，紫外检测波长281 nm 及电离方式:(+)ESI:质谱扫描范围m/z200～800 进行HPLC－MS/MS 检测.结果在大鼠胆汁中发现2个罗通定代谢产物，初步推测结构为罗通定单羟基化后再与葡萄糖醛酸结合的产物［12］.张芳等对9－硝基喜树碱代谢物的HPLC－MSn 分析.静脉注射6 mg/kg 的9－硝基喜树碱12 h 后，收集大鼠胆汁，取2 mL 离心10 min，取上清液.C18固相萃取小柱上样1 mL，分别用1 mL 水、甲醇洗涤，收集洗脱液备用.对大鼠胆汁样品进行LC－MSn 分析，确定了6个代谢产物化合物结构，其中4个已知，2个未知，4个已知代谢物分别为:9－羟基喜树碱的葡萄糖醛酸结合物、9－乙酰胺基喜树碱、9－氨基喜树碱、9－羟基喜树碱［13］.

2 中药体外代谢研究方法

2.1 肝微粒体体外孵育法

采用从肝脏中提取的肝微粒体，加入还原型辅酶Ⅱ再生系统，在体外模拟体内生理环境下进行代谢反应，采用HPLC、UPLC、HPLC－MS 等方法对原药及代谢产物进行分析测定的一种体外代谢实验.如:建立Beagle 犬肝微粒体中葛根素及其代谢物的液相色谱质谱测定方法，超速离心制备肝微粒体，Shimadzu－ODS 色谱柱(2.0 mm×150 mm，5 μm);流动相甲醇－水梯度洗脱，正离子模式，选择离子扫描m/z417(M+H)+(葛根素)，m/z531(2M+Na)+(大豆苷元).结果在体外代谢系统中，葛根素在肝微粒体中呗代谢为大豆苷元［14］.黄琳等采用LC－MS/MS 研究人体及人肝微粒体内盐酸非洛普代谢产物.建立人肝微粒体孵育体系中加入盐酸非洛普，常规温孵，采用液质联用仪分析孵育体系中的代谢产物，结果在人肝微粒体孵育体系中，除原型外共检测到6个代谢产物，m/z 分别为360.1、342.2、415.1、281.4和330.2，推测其分别为盐酸非洛普氧化、脱氢、甲基化并结合甘氨酸、失掉相对分子质量62.6 片段以及脱甲基的产物［15］.

2.2 离体肝灌流法

离体肝灌流法与其他体外肝代谢方法比较，保留完整细胞的营养液供给，能在一段时间内维持肝脏的正常生理、生化功能，并能排除其他器官组织的干扰，定量观察受试物对肝脏的作用.如:崔升淼等采用大鼠离体肝灌流模型，研究葛根素在大鼠肝脏中的代谢以及维拉帕米、红霉素和利福平对葛根素代谢的影响，以1、10、50 mg/L 的葛根素溶液对大鼠离体肝脏进行灌流，HPLC 法测定灌流液中葛根素的浓度;再分别在含10 mg/L 的葛根素溶液中加入不同量的维拉帕米、红霉素、利福平后对肝脏进行灌流，测定葛根素的消除情况.结果表明:葛根素从大鼠肝脏的消除为线性动力学过程;维拉帕米和红霉素对葛根素在大鼠离体肝脏的消除有抑制作用;利福平对葛根素在大鼠离体肝脏的消除有促进作用［16］.

2.3 重组P450 酶体外温孵法

重组P450 酶系即利用细胞及基因工程，将调控P450 酶表达的基因整合到细胞或大肠杆菌，经细胞培养，表达高水平的P450，纯化可得单一P450同工酶系.Amato 等运用基因重组人肝中P450 酶亚型研究N，N－二甲基甲酰胺(DMF)和N，N－二乙基甲酰胺(DEF)(两种肝毒性溶剂)的代谢，结果表明，DMF 的代谢只被CYP2E1 诱导，而DEF 可被CYP2E1、2C10和3A4 诱导，因而在DMF 的代谢中，CYP2E1 的表达是至关重要的，不同个体间CYP2E1 表达的差异决定了个体差异对DMF 耐受的差异［17］.

2.4 肝细胞体外温孵法

原代肝细胞由于包含了几乎肝脏所有的药物代谢酶及相应辅助因子，代谢功能与体内肝细胞相似，具有高活性与高代谢能力，能较好的反映药物在体内代谢的情况，一直是体外药物代谢研究推崇的经典模型.这种体外模型具备内源和外源物质代谢的Ⅰ相酶和Ⅱ相酶，比单一酶系统如微粒体酶更能在近乎生理状态条件下反映药物代谢情况.与肝微粒体温孵法类似，制备肝细胞辅以氧化还原型辅酶，在模拟生理温度及生理环境条件下进行生化反应的体系，有助于研究药物的代谢途径和代谢产物;研究参与代谢反应的酶;预测和解释药物间的相互作用;研究蛋白及mRNA 水平药物代谢酶诱导及酶活性在评估代谢过程中药物间相互作用时得到广发应用［18］.

2.5 离体肠道菌群代谢

肠道菌群在药物代谢中起到重要的作用［19］.因而，近年来对离体肠道菌群代谢的研究引起了广大学者的高度重视.在肠菌培养液中加入受试中药，在适合的条件下(多为厌氧)培养，进行空白对照，采用HPLC－MS、UPLC－MS/MS 等技术检测代谢产物.如:张钰哲采用LC/MS/MS 法检测离体肠内菌对甾体皂苷样品的代谢产物.给大鼠灌胃15 mg/kg 甾体皂苷，收集不同时间点尿样及粪样备用，对主要的代谢物进行结构鉴定.比较大鼠离体和在体样品，结果发现甾体皂苷样品容易被大鼠消化道菌群代谢，且代谢速率快［20］.徐文等采用高效液相色谱法考察了离体大鼠肠道菌群对淫羊藿苷的代谢.将待测物与新配制的大鼠肠内容物混悬液在37 ℃孵化，同时测定孵化前后溶液中淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ的浓度.结果淫羊藿苷迅速被肠道菌群代谢为淫羊藿次苷Ⅱ，而淫羊藿次苷Ⅱ不被代谢［21］.周鹏飞等采用TLC和HPLC 对肠菌代谢产物进行分析.将人肠道内细菌加入GAM 培养基，37 ℃离体厌氧培养24 h 得到肠道菌孵育液，对照组取经灭活的肠道菌孵育液与芦丁37 ℃厌氧温孵，代谢组取有活性的肠道菌孵育液与芦丁37 ℃厌氧温孵，采用TLC和HPLC 对肠菌代谢产物进行分析.结果对照组24 h 内芦丁水解34.2%;代谢组24 h 内芦丁减少98.2%，并最终代澍完全.对照组在48 h 内一直有槲皮索出现;代谢组有槲皮素出现，36 h 时消失，15～21 h 代谢组的槲皮素含量升高，且明显高于对照组.离体培养的人肠道菌群可以对芦丁进行代谢，可能的代谢途径有2种:一种途径是糖苷键断裂转化为槲皮素，槲皮素经代谢转化为其他成分;另一种是不经槲皮素直接转化为其他物质［22］.

3 中药复方体内外代谢研究

3.1 中药复方体内代谢研究

灌胃给予中药复方后，采集血、尿、粪等样品，处理后经HPLC、UPLC、HPLC－MS 等方法分析样品中的化学成分.如:李文兰等［23］对八珍汤给药后所得血清样品，应用HPLC－DAD－MS 联用技术，在线进行选择离子扫描(SIM)、二级碎片离子全扫描，对八珍汤的体内代谢化学成分进行解析.结果在鼠口服八珍汤后从血中发现了22个入血成分，其中16个成分为八珍汤所含成分的原型，6个为新产生的代谢产物，其中原型成分分别为白术内酯Ⅰ、5－羟甲基－2－糠酸、羟基芍药苷、白术内酯Ⅲ、芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、阿魏酸、藁本内酯、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1;代谢产物分别为芍药苷代谢素Ⅰ、3－O－β－D－18β－甘草次酸单葡萄糖醛酸苷、甘草次酸人参皂苷Rh1、人参皂苷Rd.陈丽红等采用HPLC－DAD－MS 技术研究了葛根芩连配方颗粒在大鼠尿液中的代谢产物的化学结构.流动相0.1% 甲酸水－乙腈∶甲醇(6∶4)，检测波长272 nm;ESI 离子源，正、负离子模式.从灌胃葛根芩连配方颗粒的大鼠尿液中，鉴定了11个代谢物的化学结构.分别为:葛根素、3'－甲氧基葛根素、7－木糖苷葛根素、葛根素－葡萄糖苷、大豆苷元－4'－O－硫酸酯、野黄芩素－6－O－葡萄糖苷、汉黄芩素、千层纸素A、甘草素等［24］.

3.2 中药复方体外代谢研究

采用肝微粒体体外温孵法、离体肝灌流、肝细胞体外温孵法、离体肠道菌群代谢等方法分析中药复方体外代谢.如:狄斌等采用高效液相色谱和质谱两用技术比较复方双黄连和黄芩单方中黄芩苷在大鼠肠道菌群中的代谢情况.利用离体实验考察黄芩苷在模拟肠道环境下的代谢产物，结果表明复方双黄连与黄芩单方中黄芩苷在模拟肠道环境下均代谢为黄芩素，且体外肠菌代谢无显著性差异，体外消除速率常数分别为0.0694/h、0.0621/h，t1/2分别为9.99 h、11.2h［25］.

4 代谢物检测方法

一般是收集、处理样品后，用溶剂提取法、柱色谱、薄层、高效液相液相色谱、超高效液相等制备，对其进行紫外、红外、核磁共振、质谱等光谱分析，推断其结构.或采用GC/MS 对样品处理液进行分析，推测代谢物结构，结合衍生物的GC/MS 分析，进一步确定结构.如:肖超妮等采用HPLC－DAD－SPE－CryoNMR－MS 无缝联仪技术确定了迷迭香的6个具有代表性的代谢产物结构，分别为鼠尾草酚、迷迭香酸、咖啡酸、6－甲氧基木犀草素－7－葡萄糖苷、高车前甙、顺－4－香豆酸葡萄糖苷［26］.林文振等采用UPLC－ESI－Q－TOF－MS/MS 技术对异鼠李素－3－O－β－D 芸香糖苷大鼠肠道菌群代谢产物进行了分析，结合对照品、CID－MS－MS 裂解碎片信息和化合物精确分子量进行化合物结构解析.从其代谢产物中鉴定了槲皮素－3－O－葡萄糖苷、异鼠李素－3－O－葡萄糖苷、山奈酚等化合物，且明确了异鼠李素－3－O－β－D 芸香糖苷在肠道菌群代谢途径主要是苷水解、脱羟基和甲基化［27］.陈怀侠等采用LC－MSn 技术研究了樟柳碱大鼠肝匀浆中的代谢产物.与原药进行对比，根据温孵液中分析物质分子质量的变化及其多级质谱数据，在培养液中鉴定出了两种代谢产物，为脱水去甲基樟柳碱和N－氧化樟柳碱［28］.

5 结语

中药经代谢后产生的药理作用是原型所导致还是代谢物或者是二者共同作用，必须要进行正确的评价才能确定，依此为新药研制提供依据.中药复方的成分较中药单味药成分复杂，在中药有效成分代谢研究的基础上开展复方代谢化学的研究，对进一步评价复方质量具有指导作用.随着中药及复方的代谢化学的广泛研究，其代谢化学的研究方法也越来越全面，对中药及复方的作用机制探讨、新药研究、中药质量评价等都起到推动作用，必将使中药进一步走向国际化、现代化.

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