菟丝子醇提液对大鼠离体心缺血再灌注损伤保护作用

于拔萃，曹国珍，田卉，王振华，郑秋生

（1石河子大学药学院／新疆特种植物药资源教育部重点实验室，石河子832002；2兰州大学药学院，兰州730000）

缺血／再灌注损伤（ischemic reperfusion injury，IRI）是临床上一种较为常见的病理现象，是指组织、器官供血中断，一定时间内再恢复血供，原缺血组织、器官不仅功能没有恢复，反而使功能障和结构损伤进一步加重的现象。随着医疗技术的发展及经皮冠状动脉腔内血管成形术、溶栓等各种治疗缺血性心脏病方法的广泛开展，心肌IRI也越来越常见，表现为再灌注后缺血的心肌出现舒缩功能降低、再灌注心律失常、心肌能量代谢障碍、超微结构的变化及血管无复流等现象。缺血／再灌注（ischemic／reperfusion，I／R）的机制至今仍未完全阐明，目前认为能量代谢障碍［1］是I／R损伤发生的基础，自由基的大量产生［2］、细胞内钙超载［3］、心肌细胞凋亡［4］、中性粒细胞浸润及血管内皮细胞功能障碍［5］等在心脏I／R过程中起着重要作用。

菟丝子为旋花科一年生寄生性蔓草菟丝子（CuscudachinensisLam．）的成熟种子，是常用的补益中药，具有补肝肾、益精明目、固精缩尿、止泻安胎的功效，其有效成分主要包括黄酮类、多糖类、生物碱类等物质，目前研究表明黄酮类可能为菟丝子的主要有效成分［6－7］。菟丝子黄酮类化合物具有清除氧自由基［8］、扩张血管、改善脑循环的作用，对心血管具有一定活性，能够减慢心律、降低血压、增加冠状动脉流量、降低心肌耗氧量和改善微循环等［9－10］。

本实验采用离体大鼠心肌缺血再灌注模型，研究菟丝子提取液对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。

1 材料与方法

1．1 动物

试验动物：成熟 Wister大鼠30只，雄性，体重300～400g，由新疆实验动物研究中心提供，合格证号：SCXK（新）2011－0004。

1．2 试剂

Langendorff恒流循环离体灌流系统（Radnoti，美国）；4SAD Instruments多道生理仪（澳大利亚Powerlab）；3001－1064多功能酶标仪（Thermo电子科技公司）；TGL 16M离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）；SOD试剂盒和MDA试剂盒，购于南京建程生物技术前限公司。其他试剂均为国产分析纯。

1．3 方法

1．3．1 菟丝子醇提液的制备

称取20g菟丝子粉末置于烧杯中，加入70%乙醇600mL，浸泡12h，提取温度40℃下超声提取40min，过滤；滤渣再次加入70%乙醇600mL，浸泡12h，40℃下超声提取40min，过滤；将两次滤液合并，减压蒸馏挥去乙醇，浓缩至最终浓度为2．5×103g／L（按含有生药量）。

在该条件下测得菟丝子总黄酮的含量为3．46%的提取液［11］。

1．3．2 实验分组

实验分组如下：

1）正常组：以K－H液平衡灌流95min；

2）模型组：以K－H液平衡灌流30min，停灌20 min，再灌45min；

3）菟丝子醇提液组：以K－H液平衡灌流20min，改用含12．5g／L的菟丝子醇提液的K－H液灌流10 min，之后停灌20min，K－H液再灌45min。

以生理记录仪记录灌流全过程心脏功能变化情况，以软件自动分析再灌注2、15、30和45min时间点各指标情况以反映心功能状况，以缺血前10min数值为基础值100%，再灌注期，实验结果以缺血前心功能百分率表示。

1．3．3 离体心脏缺血再灌注模型

方法参照文献［12］所述并稍作改良。具体如下：

取大鼠称重，60mmol／L 的水合氯醛（0．35g／kg，ip）腹腔注射麻醉。仰卧固定，迅速开胸取出心脏（连带较短的主动脉血管），置于95%O2与5%CO2混合气体充分饱和4℃的K－H液中，轻柔挤压，排出淤血，然后将心脏固定于Langendoff装置上，用95%O2和5%CO2混合气体充分饱和的37℃的K－H缓冲液恒压逆行灌流。剪开左心耳，球囊从左心耳开口处插入左心室，球囊内压调至6～9 mmHg。

球囊导管连接压力换能器，与4导联多功能生物记录仪（AD Instruments）相连，连续记录如下指标：心率（HR）、左心室舒张压 （LVEDP）、左心室收缩压（LVSP）、计算左心室发展压 （LVDP，LVDP＝LVSP－LVEDP），Chart 5记录软件自动分析左心室压力最大升高速率（＋dp／dtmax）以及左心室压力最大下降速率（－dp／dtmin）以计滴器实时记录冠脉流量（CF）。

1．3．4 心肌组织SOD活性、MDA含量测定

心脏灌流结束后，切取0．5g左心室组织，置于匀浆器中，用冰生理盐水按1∶9（W／V）比例制备成心肌组织匀浆，10500r／min，4℃离心10min取上清液，严格按试剂盒方法测定。放入－20℃冰箱中保存，待测。

1．3．5 数据处理

所有实验数据以¯X±S表示，采用SPSS10．0软件，以单因素方差分析进行组间统计学比较，P＜0．05表示具有显著性差异。

2 结果与分析

2．1 菟丝子醇提液对离体大鼠心脏缺血再灌注损伤后功能恢复的影响

心脏缺血前左心室发展压LVDP（图1）、心室收缩最大速率（＋dp／dtmax）（图2）、心室舒张最大速率（－dp／dtmin）（图3）均没有显著性的差别。缺血再灌注后，心肌舒缩功能明显下降（P＜0．01）。与模型组比较，菟丝子醇提液预处理可促进心肌舒缩功能的恢复，与模型组相比较具有统计学意义（P＜0．01）。control为正常组，I／R 为缺血再灌注组，CCLE为菟丝子提取液组，I／R与control相比，＊＊P＜0．01；CCLE与I／R相比，##P＜0．01（n＝6）。＊＊P＜0．01。

2．2 对心率（HR）的恢复作用

菟丝子提取液对大鼠离体心缺血再灌注心率（HR）的影响结果见表1。

由表1可知：心脏缺血前HR无明显差异．在缺血再灌注刚开始很短的时间内，心脏HR明显降低，但随着再灌注时间的变化，心脏心率有较好的恢复，总体仍低于缺血前。与正常组比较，I／R组HR明显降低（P＜0．05），具有数据统计学意义；但菟丝子醇提液预处理组较I／R组HR无明显的改善。

2．3 对心脏冠脉流量（CF）的改善作用

菟丝子提取液组对大鼠离体心缺血再灌注冠脉流量（CF）的影响结果见表2。

由表2可知：心脏缺血前CF无明显差异。再灌后与正常组比较，I／R组CF略有降低但无统计学差异；与模型组相比，菟丝子醇提液预处理组的CF无明显差异，无统计学意义。

2．4 菟丝子醇提液对缺血再灌注损伤大鼠离体心脏SOD、MDA的影响

从表3数据可知，I／R组与正常组相比，其心肌SOD酶活力显著降低，MDA含量显著升高（P＜0．01）；菟丝子醇提液组与正常组相比心肌SOD酶活力仍明显下降，但同I／R组相比显著升高（P＜0．01）；菟丝子提取液组与正常组相比心肌MDA含量让处在较高水平，但同I／R组相比显著降低（P＜0．05）。

3 讨论

菟丝子的化学成分主要包括香豆精、黄酮、甾醇类、多糖等［6］。研究表明无论是醇提物或是水提物对心血管系统都有一定作用，包括减轻实验性心肌缺血的程度和范围，有效改善心脏血流动力学，增加冠脉流量，降低心肌耗氧量等［13－16］。心肌缺血再灌注导致的心肌可逆性或不可逆性损伤均造成心肌舒缩功能降低，表现为持久的心输出量减少，心室内压量大变化速率降低，再灌溉性心律失常、心肌内酶的外漏和冠脉流量减少［17］。本研究表明，缺血再灌注后LVDP、＋dp／dtmax和－dp／dtmin均下降，HR 减慢，结果与文献报道一致［18］。CCLE能显著改善LVDP、＋dp／dtmax和－dp／dtmin恢复率（P＜0．01），HR和CF的恢复率也有所提高。结果显示菟丝子醇提物对大鼠心肌缺血再灌注损伤有保护作用。

菟丝子醇提液的生物学作用主要与其黄酮类化合物有关，如槲皮素、紫云英甙、金丝桃甙等［6］。最近研究显示，菟丝子提取物均具有一定的体外抗氧化活性［19］。菟丝子提取物同样能减少大鼠脑组织、小鼠肝脏及神经细胞的氧化损伤［20－22］。大量的实验研究证明：在缺血再灌注过程中，大量自由基生成，自由基对细胞的主要损伤是能够引起构成生物膜的不饱和脂肪配发生脂质过氧化反应，使细胞的膜功能遭到破坏。MDA是生物膜发生脂质过氧化反应的代谢产物，其含量的变化间接反应了组织中自由基含量及肌体内环境中氧化应激状态。SOD是体内抗氧化物酶系统成员之一，其活性能反映生成过氧化氢，后者过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－Px）的作用下转变成水，从而减少自由基在体内蓄积，抑制脂质过氧化，维护组织细胞的正常结构与功能［23］。本研究表明，心肌组织中SOD活力明显增高，脂质过氧化反应产物MDA含量降低。由此可见CCLE可以抑制缺血再灌注所致的氧化胁迫损伤，同时降低脂质过氧化，减轻心肌氧化损伤。

综上所述，CCLE具有明显抗离体心脑缺血再灌注操作的作用，其机制可能是通过提高心肌细胞清除自由基能力而发挥心肌保护作用。

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