犬繁殖生物技术

罗兴权

犬的繁殖与良种培育是养犬、训犬、用犬工作的前提和基础。本文简要综述了犬精液冷冻和人工授精、发情调控、早期妊娠诊断、诱发分娩、胚胎移植及克隆等繁殖生物技术的研究概况。

犬繁殖技术的研究起始于18世纪，意大利生理学家Spallanzani在1880年首次进行犬人工授精试验取得了成功，但目前犬繁殖生物技术的研究远远落后于其他哺乳动物。这是因为犬的生殖生理具有独特性，对其还缺乏准确的了解，这使得犬繁殖生物技术面临着一些困难，尤其是卵子和胚胎在体外培养及发育的效率很低。

犬繁殖生物技术如人工授精与精液冷冻、诱导发情、早期妊娠诊断、诱发分娩、胚胎移植、体外受精等胚胎体外生产技术以及克隆技术的应用不仅能够提高良种犬繁殖潜能，还能保存其基因资源及开展基础研究，因此犬繁殖生物技术的发展具有重要意义。

一、人工授精与精液冷冻

犬人工授精技术是一种代替犬自然交配的繁殖技术，是在人工辅助下，采集种犬精液、经过品质检测和稀释保存等处理，再将精液输送到母犬生殖道内，使母犬受孕的配种技术。精液冷冻技术是指将采集到的新鲜精液，经过特殊处理后，利用液氮（-196℃）、干冰（-79℃）或其他冷源，以冻结形式长期保存精液的技术。

早在1880年，意大利生理学家Spallanzani首次用犬进行人工授精试验取得成功并产下3头小狗。1959年首次报道了犬的冻精人工授精获得成功，之后犬精液冷冻已成为犬生殖生理学研究的一部分。美国养犬俱乐部（American Kennel Club,AKC）在20世纪70年代即花费大量的资金用于犬的冷冻精液和人工授精研究，并详细制定了冷冻精液生产及人工授精各主要环节的操作规程；同时规定从1981年起，只有经过审验合格的配种站才有资格提供犬的冷冻精液。在国内，禹学礼等对豫西土狗的冷冻精液和人工授精试验获得成功，受胎率最高可以达到57.1%，平均每窝产仔3头。

二、发情调控

发情调控是人为地改变母犬发情状况的一项繁殖技术，包括诱导发情、超数排卵和同期发情等。对具有优良遗传性能的母犬，可使用激素催情诱发排卵，使其在非发情期妊娠，缩短分娩间隔或改变妊娠时间，以提高产仔性能。

犬的发情周期较为特殊，不同于季节性一次发情周期动物，亦不同于全年繁殖的动物。它有一个较长的黄体期(90天左右)，以至于被认为是季节性一次发情周期的动物。犬基本上全年可繁殖，只是春秋两季发情较集中，称配种季节。母犬到了性成熟年龄后和配种季节到来后仍未见发情，可采用激素诱导发情。

三、早期妊娠诊断

目前，犬常用的早期妊娠诊断方法主要有：

(一)外部观察法 根据母犬妊娠后行为、体重、乳腺和外生殖器的一系列规律性变化来判断是否妊娠。外部观察法可以早期诊断妊娠，但是其准确率较低，更无法分辨妊娠与假妊娠。

(二)触诊法 经腹壁触诊子宫可早期诊断出妊娠，其准确性因犬的性情、大小、妊娠阶段、胎儿数目、肥胖程度以及施术者的经验而异。

（三）超声波诊断法 此法是通过线型或扇型超声波装置探测胚泡或胚胎的存在来诊断妊娠的方法。最早可以确认胚泡的时间是交配后第l8～19天，此时图像不十分清楚。交配后第20～22天的图像清晰，交配后第35～38天可以观察到胎儿的脊柱。

（四）超声多普勒法 通过子宫动脉音、胎儿心音和胎盘血流音来判断是否妊娠的方法。超声多普勒法在交配后第23天即可以诊断、交配后第25天可以听到胎儿心音及胎盘血流音，其诊断准确率很高。

（五）激素水平测定法 胚胎附植以后胎盘即产生并分泌雌激素，它有促黄体作用和抗黄体溶解的作用，从而将使激素维持一个较高水平防止子宫收缩和保证胎儿的正常发育而不致于被排出。所以通过对雌激素水平的测定可用于妊娠诊断。利用激素水平进行犬的妊娠诊断不宜使用孕激素测定法，因为妊娠与未妊娠犬在排卵后都会形成黄体并且都可长时间分泌孕酮，所以外周血的孕酮水平无显著差异。

（六）腹腔镜检查 是指对待检母犬先进行常规麻醉、肚脐后24cm腹中线做小切口然后根据母犬个体大小选择一定直径的腹腔镜筒伸入母犬腹腔观察母犬是否妊娠以及妊娠情况的一种方法。此种方法不但可用于妊娠诊断还可用于检查子宫积脓、卵巢囊肿、子宫外孕以及结扎输卵管、腹腔取样等操作。腹腔镜检查不影响动物的繁殖力。

（七） 血液学检查 犬妊娠期血液容量增加血液成分发生一系列变化。测定这些变化不仅有助于妊娠诊断而且有助于区分妊娠与假妊娠。

四、诱发分娩

据报道，Moriyoshi等(1999)用fellptalene(一种PGF2a类似物)在母犬妊娠第56～58天以5ug/kg体重进行肌肉注射诱发分娩，注射后母犬出现流涎、呕吐、水样腹泻和绞痛综合症等副作用。Fieni等(2001)用抗孕酮在母犬妊娠第58天以5mg/kg体重进行皮下注射，24小时后每隔2小时注射催产素0.15IU/kg体重，直到分娩结束。结果分娩发生在注射抗孕酮后3l.6小时，产程为4.5小时，产活仔率93.1%，48小时存活率86.21%，与自然分娩相当。

五、胚胎移植

1977年最先报道了犬受精卵的移植成功，武石等(1988)首次报道人工诱情移植受精卵并繁育出仔犬。采用犬体内来源的胚胎进行胚胎移植已经产生了活的后代，但成功率比较低。Tsutsui等(2001)认为犬的胚胎移植受超数排卵和同期发情的限制，成功率较低，并且比较了子宫切除法与手术法这两种冲胚方式的胚胎回收率，前一种方法显著高于后一种(97.1%，42.5%)。

六、克隆

韩国科学家黄禹锡和他的同事历时两年半成功地克隆出了世界上首只克隆犬“斯纳皮”（Snuppy)，并在2005年8月4日出版的《自然》杂志上发表了他们的研究成果。Hwang等(2005)将成年阿富汗公猎犬的耳上皮细胞移植到排卵72 h后体内成熟的去核卵母细胞卵周隙中，融合激活后将重构胚（共1095枚）移入代孕自然发情母犬（共123头）的输卵管或子宫角内，其中1头代孕的拉布拉多猎犬于60天后产下“斯纳皮”，另外1头代孕的杂种母犬产下的克隆狗因肺炎于出生后22天死亡。

犬繁殖生物技术的发展比较缓慢，主要是因为犬的生殖生理和其他哺乳动物不同，而且对其研究也比较匮乏。尽管近几年来对犬繁殖生物技术的研究逐渐增多，也成功克隆了一头犬，但目前犬体外胚胎生产以及克隆等技术由于受到卵母细胞体外成熟率低的影响而受到限制。随着各种生物技术的发展，对犬特有的生殖生理现象与繁殖生物技术的研究将会更加深入地开展。