补阳还五汤对血管性痴呆大鼠海马CA1区LTP及ERK2与CaMKIIβ mRNA表达的影响

唐敬龙， 高维娟， 钱 涛， 张泓波， 李 君

血管性痴呆(Vascular Dementia，VD)是指各种脑血管病引起脑功能障碍而产生的获得性智能损害综合征，为一慢性进行性疾病，长时程增强(longterm-potentiation，LTP)效应反映神经元突触可塑性，是学习和记忆的突触模型［1］，反映了突触水平的记忆过程［2，3］，因此 LTP 被公认为是学习和记忆的神经生物学基础［4］。细胞外信号调节激酶2(Extracellular signal-regulated kinase，ERK2)参与海马神经元的可塑性，钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱβ(calci-um/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ β，CaMKIIβ)则参与突触构建过程，促进学习记忆的恢复［5］。补阳还五汤是益气活血中药的代表，是中医治疗“呆病”的经典方剂，已经证实其有显著的抗VD 作用［6～9］，但其电生理机制尚未阐明，本实验采用在体大鼠海马CA3侧枝-CA1区长时程增强记录方法记录海马CA1区LTP，采用RT-PCR技术检测其海马组织ERK2和CaMKIIβ mRNA的表达，从电生理角度、基因水平探讨补阳还五汤对VD大鼠海马神经元突触可塑性的影响。

1 材料与方法

1.1 VD动物模型制备及分组 成年SD雄性大鼠40只，体重220±20g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号:SCXK(京)2007-0001，SPF级。通过水迷宫试验筛选出智力水平相当的大鼠，并随机分为假手术组，模型组，补阳还五汤组，尼莫地平组，每组10只。采用四血管阻断(four-vessel occlusion，4VO)方法制备 VD动物模型［9］:大鼠于术前 12h禁食，4h禁水，戊巴比妥钠(45mg/kg)腹腔麻醉。将大鼠伏卧固定于固定台上，行背侧颈正中切口，逐层钝性分离暴露双侧第1颈椎横突翼小孔，用直径0.5mm的电凝针烧灼双侧翼小孔内的椎动脉，造成永久性闭塞。24h后再将大鼠麻醉，仰卧固定，行腹侧颈正中切口，钝性分离双侧颈总动脉，用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉5min，共夹闭3次，每次间隔1h。假手术组只做皮肤切口和组织分离处理，不进行椎动脉烧灼和颈总动脉夹闭，皮肤缝合后正常饲养。模型组大鼠造模后自然饲养;补阳还五汤组、尼莫地平组大鼠造模后分别灌服补阳还五汤(50g/kg/d)和尼莫地平(20mg/kg/d);模型组、假手术组均给予生理盐水(10ml/kg/d)灌胃，2 次/d，连续给药30d。

1.2 药物制备 补阳还五汤购自北京同仁堂医药公司，批号为080103;按原方所载的各药(黄芪120g:当归尾6g:赤勺4.5g:地龙3g:川芎3g:红花3g:桃仁3g)配方，制成浓度为 6.25g生药/ml的混悬液。尼莫地平，国药准字 H41022175，批号为080317，规格20mg/片:用双蒸水经超声细胞粉碎机制成浓度为2.5mg/ml的混悬液，高压灭菌，4℃保存，用前摇匀。

1.3 主要仪器 WH-A300W型高频电刀(北京市朝阳维思通工程电器厂)，LW2II型Morris水迷宫(中国医学科学院药物所);SR-6N型头颅立体定位仪(Narishinge，Japan);M0310型牙科钻，淮安市天剑工具厂;PowerLab信号采集分析系统(Australia)。

1.4 大鼠行为学检测 采用Morris水迷宫实验检测各组大鼠空间探索行为能力，判断各组大鼠空间记忆的认知能力。空间探索实验:术后29d撤除平台，将大鼠放入水池中，记录大鼠在90s内在各象限游泳的距离和平台象限距离占总距离的百分比。

1.5 大鼠海马CA3侧枝-CA1区长时程增强记录 术后30d，用30%乌拉坦(4ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，固定于头颅立体定位仪。大鼠头顶部剪毛备皮，碘伏消毒，切开大约1.5cm皮肤切口，暴露颅骨。以刺激电极和记录电极在颅骨的投影位置使用牙科钻在颅骨打开一个直径约5mm圆形窗口。

以前囟为参考点分别定位刺激电极和记录电极位置。刺激电极位置在前囟后4.2mm，向左旁开3.5mm;记录电极在前囟后 3.5mm，向左旁开2.5mm。将刺激电极和记录电极轻轻插入左侧海马，刺激电极的深度为脑膜下2.5mm，记录电极的深度为脑膜下2mm。放置刺激电极和记录电极后，刺激电极与PowerLab的刺激器连接，记录电极与经前置放大器与滤波及放大器相连，LTP信号经滤波(Neurolog NL 104;NL 125)及PowerLab转换获得。在scope软件窗口中记录兴奋性突触后电位(EPSP)，调节两个电极的位置，以引出最大EPSP为目的。随后给予单刺激，刺激强度从 0.1mA到1.0mA，记录在不同刺激强度下EPSP。以达到最大EPSP负向波幅深度的1/3的所用的刺激强度作为记录电流强度，每分钟给予3次刺激，共20min。记录基础EPSP，记录后给予高频刺激(频率为200Hz的串刺激，脉冲组数为10，主周期为2S，重复次数为10)。然后再给予每分钟3次的刺激，记录60min。分析兴奋性EPSP的斜率。

1.6 RT-PCR检测海马组织ERK2和CaMKIIβ的表达 用Trizol一步法提取RNA，按Takara RNA PCR kit说明逆转录为cDNA。内参照β-actin的引物序列上游引物为5’CACCCGCGA GTACAACCTTC-3’，下游引物为 5’-CCCATACCCACCATCACAC C-3’，扩增片段长度为207bp，按照 PCR amplification kit说明进行反应，扩增条件:95℃预变性3min，94℃ 40s，54℃ 40s，72 ℃3min，循环 35 次，最后72℃3min。ERK2 cDNA引物序列上游引物为5’-ACCTCAAGCCTTCCAA CCTCC-3’，下游引物为 5’-CAGAGCCTG TTCAACTTCAATCC-3’，扩增片段长度为479bp，按照PCR amplification kit说明进行反应，扩增条件:95℃预变性3min，94℃ 20s，54℃ 30s，72℃ 3min，循环35 次;最后72℃3min;CaMKIIβ cDNA引物序列上游引物为5’-ATGTATCTCGCCTCCAAGCCTCT-3’，下游引物为 5’-GCACTCCTACCATCAAACCC TCAC-3’，扩增片段长度为413bp，按照PCR amplification kit说明进行反应，扩增条件:95℃预变性 3min，94℃ 40s，54℃ 40s，72℃ 3min，循环30次;最后72℃3min。用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，以 β-actin为内参照，凝胶分析软件Quantity one进行半定量分析。

2 结果

2.1 补阳还五汤对大鼠游泳路径的影响 模型大鼠水迷宫运动轨迹呈4个象限均衡分布，而假手术组，补阳还五汤组和尼莫地平组大鼠运动轨迹主要集中在平台象限(见图1)。各组大鼠(假手术组、补阳还五汤组、尼莫地平组和模型组大鼠)平台象限游泳的时间/游泳总时间分别为0.38±0.09、0.35 ±0.07、0.33 ±0.06、0.12 ±0.03，平台象限游泳距离/游泳总距离分别为 0.37 ±0.07、0.36 ±0.08、0.33 ±0.05、0.18 ± 0.04，模型组均显著小于假手术组(P＜0.05)，而补阳还五汤组和尼莫地平组均大于模型组 (P＜0.05)。补阳还五汤和尼莫地平组之间差异无显著(P＞0.05)(见图2)。

2.2 高频刺激(HFS)对各组大鼠海马CA1区LTP的影响 各组大鼠海马在给予HFS前的基础对照值(baseline)之间没有明显差异(见图4)。给予HFS后，假手术组，补阳还五汤组和尼莫地平组和模型组大鼠的EPSP斜率百分比分别为154.18%±6.78%、147.23% ± 7.55%、143.91% ± 8.09%、121.33% ±6.45%，各组大鼠的 EPSP斜率百分比均有增强，说明了HFS成功地诱导出稳定的LTP。但模型大鼠EPSP的斜率百分比显著弱于假手术组大鼠(P＜0.05);而补阳还五汤和尼莫地平组EPSP的斜率百分比较模型组显著升高(P＜0.05)。补阳还五汤组和尼莫地平组大鼠相比EPSP斜率无明显差异(P ＞0.05)(见图3、图4)。

2.3 补阳还五汤对血管性痴呆大鼠海马组织ERK2与CaMKIIβ mRNA表达的影响 与假手术组比较，模型组大鼠海马ERK2与CaMKIIβ mRNA表达均显著减少(P＜0.05)，而补阳还五汤组和尼莫地平组ERK2与CaMKIIβ mRNA表达则明显高于模型组(P＜0.05)，且两组相比无显著差异(P＞0.05)(见图5、图6)。

图1 各组大鼠游泳轨迹图

图2 各组大鼠象限游泳距离和时间比值的比较

图3 高频刺激对各组大鼠海马CA1区LTP的影响

图4 记录20min基础电流后，给予高频刺激诱导LTP产生

图5 术后30d补阳还五汤对大鼠海马组织ERK2 mRNA表达的影响

图6 术后30d补阳还五汤对大鼠海马组织CaMKIIβ mRNA表达的影响

3 讨论

补阳还五汤是益气活血中药中的经典方剂，由黄芪、当归尾、芍药、川芎、桃仁、红花、地龙组成，具有补气、活血、通络功效，给予补阳还五汤治疗后大鼠平台象限游泳的时间和距离与总游泳时间和总距离之比补阳还五汤组大鼠均显著大于模型组，表明补阳还五汤可显著改善大鼠学习记忆能力。用以防治缺血性脑血管病，从而改善学习记忆功能［5，6］。

长时程增强(LTP)是记忆的分子机制之一［4］，本实验中通过记录兴奋性突触后电位(EPSP)的变化以及大鼠海马组织ERK2与CaMKIIβ mRNA表达，以了解补阳还五汤对血管性痴呆大鼠学习记忆的影响及其对海马神经元突触可塑性的影响。学习记忆的神经生物学基础是神经细胞之间的联系结构突触的可塑性变化，大脑边缘系统海马结构作为学习记忆的关键部位，是一个具有可塑性的脑区。而LTP被认为是研究学习和记忆的神经元可塑性的最好的模型［10］。LTP的形成是突触前后机制共同作用的结果，与突触前神经递质释放、突触后相关受体的Ca2+通道、蛋白激酶、逆行信使、即早基因等关系密切。现已经明确，CaMKII是突触后致密区(PSD)的重要组成部分，可占PSD总量的30% ～50%，同时ERK2也参与突触后膜的构建。该实验研究表明给与补阳还五汤治疗后ERK2与CaMKIIβ mRNA表达明显上调，基因表达上调可使转录翻译水平加强，从而使蛋白表达增多，从而促进了突触后膜的构建［5］。突触后膜的构建使LTP电活动增强，而LTP的增强同时也促进了基因的表达，研究表明，利用基因敲除技术，将CaMKII的α亚单位敲除，发现小鼠空间认知缺乏，海马脑片的LTP诱导也受到损伤［11］并且降低 LTP幅度 50%左右，残余的 LTP是CaMKIIβ的功能［12］，也有力支持本实验结果。同时补阳还五汤组大鼠LTP较模型组大鼠EPSP斜率明显上升，表明补阳还五汤可明显增强突触可塑性，促进LTP表达，提高其学习记忆能力。

总之，补阳还五汤在提高VD大鼠海马CA1区LTP的EPSP斜率，与其在行为学上改善VD大鼠学习记忆能力一致。由此我们可以推断补阳还五汤可以通过增强ERK2、CaMKII基因表达，增强神经元突触可塑性，促进LTP表达，从而改善VD大鼠学习记忆能力，两者是相辅相成，互为因果。我们将在下一步的试验中对补阳还五汤的作用靶点做进一步研究。

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