带菌砧木种子和灌溉方式对西瓜嫁接苗细菌性果斑病（B F B）发生的影响

牛庆伟，蒋薇，孔秋生，黄远，别之龙

（园艺植物生物学教育部重点实验室/华中农业大学园艺林学学院，武汉，430070）

西瓜细菌性果斑病是由燕麦嗜酸菌西瓜亚种（Acidovorax avenaesubsp.citrulli）引起的瓜类细菌性果腐病，简称BFB，该病是典型的由种子带菌引起的传染性病害，也是我国规定的检疫性病害之一。该病最早于1969年由Crall和Schenck[1]在美国佛罗里达州发现，我国1985年发现并开始报道瓜类BFB的发生和为害[2～4]。BFB病菌寄主主要有西瓜、罗马甜瓜、蜜露洋香瓜和网纹洋香瓜等，采用人工接种的方式其也可以感染其他葫芦科作物，如黄瓜、甜瓜、节瓜、瓠瓜、南瓜、丝瓜、苦瓜、西葫芦等[5]。BFB病菌主要附着在种子和病株残体上越冬，种子带菌为主要初侵染源，病菌随风、雨或灌溉水从植株气孔或伤口侵入，病菌在病株上大量繁殖扩展，造成再次侵染[6]。

近年来，越来越多的育苗工厂出现BFB的发生与流行，导致经济损失严重。但到目前为止，对于BFB还没有一种可以彻底控制的方法。研究BFB在西瓜嫁接育苗过程中的发生规律对防控西瓜BFB的发生与流行具有重要意义。研究表明，在西瓜嫁接育苗过程中带菌接穗种子、带菌育苗基质和带菌嫁接用具均能导致嫁接苗BFB的发生[7～9]。带菌砧木种子、灌溉方式对西瓜嫁接苗BFB发生的影响如何，目前尚不知晓。Bahar等[10]通过试验证明BFB病菌能够通过木质部导管向下和向上移动从而系统侵染甜瓜幼苗。本研究对西瓜砧木种子人工接菌，采用发病砧木幼苗与健康接穗幼苗为嫁接材料，初步探索BFB病菌在嫁接苗上的侵染途径，研究带菌砧木种子与西瓜嫁接苗BFB发生间的关系。曾义安等[11]曾指出土传病害枯萎病、非土传病害病毒病、霜霉病和灰霉病在嫁接植株上的病情指数和发病率均低于自根植株。本研究采用人工喷雾接种的方法鉴定不同类型嫁接苗对BFB的抗性。赵廷昌等[5]曾指出在温室中，由于人工灌溉等原因，可使BFB病菌自然接种到同株叶片或邻近的幼苗上，带病幼苗移入田后，借雨水或喷灌水而传播感染。本研究明确了不同灌溉方式与嫁接苗BFB发生间的关系，提出了有利于控制病害的灌溉方式。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试砧木品种为京欣砧一号，购自北京京研益农科技发展中心。供试接穗品种为早佳“84-24”，购自新疆明鑫科鸿农业科技有限责任公司。育苗基质为草炭∶珍珠岩=2∶1（体积比）。西瓜BFB病菌为pslbtw20，该病原菌属于Aac，由中国农科院植保所赵廷昌研究员惠赠。

供试培养基为KBA培养基：硫酸镁1.5 g、磷酸氢二钾 1.5 g、琼脂 20 g、甘油 10 g、蛋白胨 20 g、蒸馏水 1 000 mL、pH 值 7.0～7.2。

1.2 试验方法

①叶片发病情况分级标准和病情指数计算 叶片发病情况分级标准参考Hopkins等[12]的方法，0级：无病；1级：叶片病斑较少，病斑面积占整片叶面积的5%以下；3级：病斑较多，病斑面积占整个面积的5%～30%；5级：病斑较多，病斑面积占整个面积的30%～50%；7级：病斑很多或融合成大斑，病斑面积占整个面积的50%以上，叶片未焦枯死亡；9级：病斑很多或融合成大斑，病斑面积占整个面积的50%以上，常使叶片焦枯死亡。

病情指数参考翟艳霞[13]的计算公式：病情指数=∑（各级病叶数×各级代表值）/（调查总叶数×最高级代表值）×100。

②试验地点 试验在华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室和国家蔬菜改良中心华中分中心连栋玻璃温室内进行。

③砧木种子接菌方法的筛选 挑选西瓜BFB病菌pslbtw20的单菌落，采用KBA液体培养基对西瓜BFB病菌进行培养 （28℃，220 r/min）， 使菌液OD600值达到 0.3～0.4（浓度约为 108cfu/mL），梯度稀释浓度分别为 107cfu/mL、105cfu/mL、103cfu/mL的菌液。种子接菌参考冯建军等[14]的浸种法并进行改进，按1 g砧木种子与2 mL不同浓度菌悬液的比例浸泡，分别振荡 30、60 min（25℃、160 r/min），取出后于超净工作台晾干备用。带菌种子浸种催芽后播种，置于25℃、RH 70%的人工气候箱中培养，共6个处理，每个处理3次重复，每次重复50粒砧木种子。待砧木适合嫁接时统计砧木幼苗的发病率和子叶病斑面积＜5%的发病砧木幼苗株数。

④带菌砧木种子与西瓜嫁接苗BFB发生间的关系 将1 000粒砧木种子按1 g种子与2 mL 105cfu/mL菌悬液的比例浸泡，振荡30 min（25℃、160 r/min），于超净工作台过夜晾干。带菌种子浸种催芽后播种，置于25℃、RH 70%的人工气候箱中培养，6 d后培育西瓜接穗幼苗。待砧木适合嫁接时，选择子叶病斑面积为5%左右的砧木幼苗，以无菌砧木幼苗为对照，采用顶插接和断根插接的方法嫁接[15]，每个处理3次重复，每次重复20株。每天调查嫁接苗的发病症状，并统计发病率。

⑤不同类型西瓜嫁接苗对BFB的抗性鉴定采用断根和顶插接两种方法嫁接[15]，研究断根嫁接苗和顶插接苗对BFB的抗性，以自根苗作为对照。试验在玻璃温室内进行，幼苗3叶1心期，采用pslbtw20菌悬液（108cfu/mL）喷雾法接种，薄膜保湿48 h，每个处理30株，3次重复。3 d后调查叶片的发病情况，第8天统计各处理病情指数。参考田英等[16]的相对抗病性方法评价嫁接苗的抗病程度，抗病程度分为免疫（I）、高抗（HR）、中抗（MR）、中感（MS）、感病（S）5 类，相对抗病指数分别为 1.00、0.80～0.99、0.40～0.79、0.20～0.39 和 0.20 以下。相对抗病指数=1-相对病情指数。相对病情指数=鉴定嫁接苗平均病情指数/对照自根苗平均病情指数。

⑥不同灌溉方式对西瓜嫁接苗BFB发生的影响 2叶1心期，嫁接苗喷雾接菌，第4天挑选病情指数相近的发病嫁接苗作为初侵染病株，移栽至健康嫁接苗群体，初侵染病株在穴盘中的分布位置如图1所示，灰色为初侵染病株的位置，白色为健康嫁接苗的位置，初始发病率分别设置为0%、4%、12%和20%。试验在人工气候室内进行，采用不同的灌溉方式提供水分，试验设计如表1所示，采用完全随机区组设计，共设8个处理，3次重复，每重复种植一穴盘。9月5日进行第一次灌溉处理，以后每隔2 d灌溉一次，每次灌溉前统计穴盘内嫁接苗的发病率，9月15日试验结束。分别于试验开始时（9月5日）和试验结束时（9月15日）统计初侵染病株的病情指数，计算BFB日增长速率。

图1 初侵染病株在穴盘中的分布位置

病 害 日 增 长 速 率 的 计 算 公 式[17]：r=1/（t2-t1）×ln[X2（1-X1）/X1（1-X2）]。式中：r 为病害日增长率；X1为前1次调查的病情指数；X2为后1次调查的病情指数；t2-t1为2次调查之间的时间距。

2 结果与分析

2.1 砧木种子接菌方法的筛选

由表2可知，砧木种子接菌浓度越高、时间越长，幼苗发病率越高。 107cfu/mL（30 min、60 min）处理下，砧木发病情况严重，不存在可以嫁接的砧木幼苗；105cfu/mL（30 min）处理下，50 株砧木幼苗中有7株可以嫁接的发病砧木幼苗，能够获得更多适合嫁接的带菌砧木幼苗。试验采用砧木种子的接菌方法为：按1 g砧木种子与2 mL 105cfu/mL菌悬液的比例浸泡，振荡 30 min（25℃、160 r/min），超净工作台过夜晾干。砧木种子人工接种试验表明，带菌砧木种子能够导致砧木幼苗BFB的发生，带菌砧木种子播种出苗后，果斑病病菌开始于子叶发病，子叶背面出现水渍状病斑，随着幼苗的生长，发病严重的砧木幼苗，病斑逐渐向叶基部侵染，并侵染茎部，最终砧木腐烂死亡。

2.2 带菌砧木种子对西瓜嫁接苗BFB发生的影响

表2 砧木种子接菌方法的筛选

砧木种子带菌导致砧木幼苗BFB的发生，选择幼苗子叶病斑面积为5%左右的砧木幼苗和无菌接穗幼苗，采用顶插接和断根嫁接的方法嫁接。结果发现，嫁接苗BFB发病率100%，砧木上的BFB病菌均可侵染至接穗（图2），随着病情发展，接穗子叶腐烂坏死，最终整株嫁接苗腐烂死亡。可见，砧木种子带菌后BFB病菌通过嫁接传递可导致嫁接苗BFB的发生，不同嫁接方法与BFB的发生无显著差异。

2.3 不同类型的西瓜嫁接苗对BFB的抗性鉴定

BFB病菌接种于不同类型的西瓜嫁接苗，幼苗从第3天开始发病，病叶初期呈现少量水浸状病斑，呈不规则形，暗青色，水浸状病斑通常沿叶脉发展，中期病斑由暗青色至暗棕色，严重时，沿叶脉发展到叶基部，叶片焦枯死亡。第8天进行相对抗病性分析，自根苗、顶插接苗和断根嫁接苗的病情指数分别为 73.1、67.9 和 71.4（图 3），顶插接苗和断根嫁接苗的相对抗病指数分别为0.07和0.02，均为感病类型。可见，嫁接苗和自根苗在苗期对于BFB的抗性没有差异，嫁接不能提高西瓜对BFB的抗病性。

2.4 不同灌溉方式对嫁接苗BFB发病率的影响

由图 4可知，A1、B1（对照）处理嫁接苗 BFB发病率为0。A2、A3、A4的发病率从第4天开始不断增加，B2、B3和B4发病率基本稳定不变。 第 10天，B2、B3、B4、A2、A3和 A4的 发 病 率 分 别 增 加 了 0.7、0.7、0.7、3.3、7.3 和 12 个百分点。 采用上部喷灌的方式有利于细菌性果斑病的传播，而且初侵染源越多病害传播的规模就越大。

2.5 不同灌溉方式对初侵染病株病情扩展的影响

由表 3 可知，试验开始时 A2、A3、A4、B2、B3和 B4初始病情指数无显著差异，试验结束时A2、A3、A4的病情指数显著高于B2、B3、B4的。病情指数的日增长率为 A2＞A3＞A4＞B2＞B4＞B3。 由此可见，采用上部喷灌方式提供水分，发病植株病情指数迅速提高，能够加速病情的恶化，潮汐灌溉能够减缓病害的扩展。

3 结论与讨论

BFB为害在我国各西瓜产区均有报道，接穗种子带菌是导致嫁接苗感染BFB的主要原因，带有BFB的西瓜种子经西瓜嫁接苗育苗场造成的毁苗率高达 30%～80%[18，19]。 本研究结果表明，在西瓜嫁接育苗过程中，砧木种子接菌浓度从103～107cfu/mL均可造成砧木幼苗BFB的发生，浓度越大发病率越高。本试验研究发现，砧木种子带菌后通过系统侵染会导致砧木幼苗BFB的发生，以发病砧木幼苗和健康接穗幼苗为嫁接材料，BFB病菌通过嫁接传递可导致嫁接苗BFB的发生，表明砧木种子可能成为西瓜嫁接苗BFB发生的来源。Tian等报道2012年7月在安徽省发现因南瓜砧木种子带菌导致西瓜嫁接苗BFB的发生现象。阎莎莎等[20]指出Aac有单根极生鞭毛，其鞭毛在侵染过程中有重要的作用，IV型菌毛可帮助病菌定殖和在维管束导管中移动。由此推测，砧木上BFB病菌可能通过木质部导管侵染至接穗。

图2 砧木幼苗发病时BFB病菌从砧木侵染至接穗的症状

图3 不同类型嫁接苗人工喷雾接种后的病情指数比较

图4 不同处理对嫁接苗BFB发病率的影响

刘龙洲等[21]在甜瓜嫁接育苗实践中发现，对于白粉病（气传叶部病害）而言，以商业甜瓜品种为接穗，部分甜瓜材料为砧木，嫁接苗比自根苗的抗性强。张继梅等[22]指出，嫁接可以有效防治枯萎病的发生，而且嫁接后西瓜苗的叶部病害抗性能力显著增强。BFB虽然是一种细菌性种传病害，但是该病菌可侵染葫芦科作物叶片，引起叶部病害，本研究鉴定了嫁接苗对BFB的抗性水平，结果表明，嫁接苗和自根苗在苗期对BFB的抗性没有差异，嫁接没有提高西瓜苗对BFB的抗性。Silva等[23]指出BFB病菌可以侵染甜瓜叶片，而且优先定殖于叶片的毛状体基部、气孔的边缘和表皮细胞间隙。韩晓燕[24]指出利用抗病砧木进行嫁接可以增强蔬菜作物对多种病害的抗性，但砧木对所抗病害的种类有一定的选择性。由此可知，嫁接苗和自根苗对BFB抗性无显著差异可能与嫁接苗叶片结构、砧木对BFB的抗性和BFB病菌的侵染特性有关。目前，还没有发现BFB的抗性砧木，在嫁接育苗过程中避免菌源的进入对于嫁接苗BFB的防治至关重要。

上部喷灌是工厂化育苗过程中常用的灌溉方式之一，但采用上部喷灌容易造成温室内高湿的环境条件，利于病虫害的发生和扩展。当前，BFB已成为威胁嫁接苗生产的主要病害，BFB病菌通过上部喷灌的方式在嫁接育苗场内不断传播与扩展，给嫁接育苗场造成了巨大的经济损失，急需一种科学、合理、防病的灌溉方式。杨仁全等[25]指出潮汐灌溉是针对容器育苗所设计的底部给水的灌溉方式，潮汐灌溉使棚内相对湿度容易控制，可保持作物叶面干燥，是一种节能、环保、高效的灌溉技术。本研究结果表明，与潮汐灌溉相比，采用上部喷灌的方式有利于BFB的传播，而且初侵染源越多，病害传播的规模越大，发病植株病情恶化迅速，采用潮汐灌溉可有效地控制BFB的发生与扩展。

在西瓜嫁接育苗过程中，砧木种子带菌后通过嫁接传递可导致嫁接苗BFB的发生，不同嫁接方法对BFB的发生无显著差异。与上部喷灌相比，潮汐灌溉能有效地控制嫁接苗BFB的发生。

表3 初侵染病株病情指数及其日增长率

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