HPLC 法测定不同品种蘑菇中麦角硫因的含量

张 翠，赵艳敏，白淑芳，刘岱琳，*

(1.中国人民武装警察部队后勤学院生药教研室，天津市职业与环境危害防治重点实验室，天津300162;2.天津中医药大学，天津300193)

麦角硫因(巯基组氨酸三甲基内盐，ergothioneine，EGT)是1909 年在麦角中发现的一种稀有化合物［1］。它是机体内的重要活性物质，但不能由动物机体自身合成，只能从食物中摄取。麦角硫因具有清除自由基、维持DNA 的生物合成、细胞的正常生长及细胞免疫等多种生理功能［2-6］，可用于开发户外护肤产品，防护性的化妆品［7-8］以及眼科产品，谷胱甘肽理想的替代品等［9］，已渐渐得到更多人的关注。目前麦角硫因的获得方式主要有化学合成和天然来源的分离［10-12］。但是化学合成的麦角硫因由于存在副产物等其他杂质而束缚了其在食品、药品与保健品领域中的应用。上世纪90 年代日本学者从日本侧耳(Ampteramyces japonicus)的子实体中分离得到麦角硫因［13］。这是首次从蘑菇中分离到该化合物。后续很多学者开始着力研究麦角硫因的分离研究［14-16］。麦角硫因的国外研究报道较多，而国内还处于探索阶段。我国的真菌资源比较丰富，目前测定麦角硫因含量的研究很少，国外曾报道过利用C18色谱柱对杏鲍菇及灵芝中的麦角硫因进行测定［17-18］，国内也有学者采用C18 色谱柱测定了双孢菇中麦角硫因的含量［19］。麦角硫因是一种稀有氨基酸，而如今对氨基酸的测定多采用氨基色谱柱，国内有人利用氨基色谱柱测定了红枣、苜蓿芽等食品中多种氨基酸的含量［20-21］。我们在文献调研的基础上结合麦角硫因的性质，首次建立了用氨基色谱柱测定麦角硫因的HPLC 检测方法，对产自天津、山东、东北三省地区的10 种蘑菇中麦角硫因的含量进行测定，麦角硫因的资源调查和蘑菇的进一步合理开发应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

10 种蘑菇样品分别为产自天津的平菇(Pleurotus ostreatus(Fr.)Kummer)、鸡腿菇(Copyinds comatus (MUII. Fr)Gray)、金针菇(Flammulina velutiper(Fr.)Sing)、海鲜菇(Hypsizygus marmoreus(Peck)H.E.Bigelow)、口蘑(Tricholomagambosum)，产自山东的白玉菇(Hypsizygus marmoreus(pk)Sing)，(以上均为鲜蘑菇)产自吉林省长白山地区的松蘑(Suillusluteus (L.exFr.) GrayBoletusluteu )、榛蘑(Armillaria mellea (Vahl ex Fr.)Quel)、猴头菇(Hericium erinaceus)和辽宁省铁岭地区的白蘑(Tricholoma mongolicum Imai)。(以上均为干蘑菇);麦角硫因标准品，含量98% 天津市科曼思特医药科技发展有限公司;乙腈为色谱级;纯净水 杭州娃哈哈集团有限公司;其他试剂均为分析纯。

高效液相色谱仪(泵型号LC-20AT、检测器SPDM20A) 日本Shimadzu 公司;MT5 电子天平瑞士梅特勒-托利多公司;HH-2 数字显示恒温水浴锅 常州市国华仪器有限公司;KQ5200E 超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;DHG-9000A 型电热恒温鼓风干燥箱 上海益恒实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制与曲线绘制 精密称取麦角硫因对照品适量，置于10mL 棕色容量瓶中，用色谱甲醇定容，摇匀，即得麦角硫因对照品溶液(0.1060mg/mL)。分别取上述对照品溶液0.5、2.5、5.0、7.5、10.0mL，置于10mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容后进行HPLC 测定。

1.2.2 待测样品前处理 称取不同品种干蘑菇各2.5g、鲜蘑菇各8.0g 于100mL 容量瓶中，加入80mL去离子水，于100℃水浴锅中加热回流提取1h，冷却至室温，用去离子水定容，摇匀，用0.45μm 微孔滤膜过滤，取滤液作为供试品溶液，于冰箱中冷藏保存。

1.2.3 样品水分含量测定［22］取粉碎成0.5cm ×0.5cm 的蘑菇样品各2g，平铺于干燥恒重的扁形称量瓶中，精密称定，打开瓶盖在100～105℃干燥5h。将瓶盖盖好，移置干燥器中，冷却30min，精密称定，再在上述温度干燥1h，冷却称重，至连续两次称重的差异不超过5mg 为止。根据减失的重量，计算样品中的水分含量(%)，平行三次，求平均值。

1.2.4 色谱条件 色谱柱:Kromasil 100-5NH2柱(250mm ×4.60mm，5μm);流动相:乙腈-5mmol/L 醋酸铵(80∶20);流速:1.0mL/min;检测波长:254nm;柱温:30℃;进样量:20μL。

1.2.5 样品含量测定 各样品按1.2.2 项下方法制备，平行三次实验，测定各供试品峰面积，代入标准曲线，计算供试品中麦角硫因的浓度C(mg/mL)，利用计算公式计算各样品的含量。将各样品质量M(mg)和水分含量W(%)代入如下公式，计算得到各样品的麦角硫因含量。

式中:C:供试品中麦角硫因的浓度(mg/mL);V=100mL;M:各样品的质量(mg);W:各样品的水分含量(%)

2 结果与分析

2.1 色谱条件的选择

本研究发现，麦角硫因在254nm 处有最大吸收，实验中流动相考察了不同比例乙腈-5mmol/L 醋酸铵(85∶15)，乙腈-5mmol/L 醋酸铵(80∶20)，乙腈-5mmol/L 醋酸铵(90∶10)等，结果发现流动相为乙腈-5mmol/L 醋酸铵(80∶20)时，麦角硫因与样品中其他杂质能达到良好的分离效果，麦角硫因的保留时间为12.7min，标准图谱见图1(A)。按照色谱峰的保留时间定性，外标法峰面积定量，口蘑样品的图谱见图1(B)。

图1 麦角硫因对照品(A)及口蘑样品(B)的HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of ergothioneine standard and sample

2.2 麦角硫因标准曲线

在规定色谱条件下，将标准品系列溶液进样20μL 进行测定，以峰面积Y 对麦角硫因的质量浓度X(mg/mL)进行线性回归。结果显示麦角硫因在0.005～0.106mg/mL 范围内与峰面积相关性较好，回归方程为:Y =4.69 ×107X-67186，R2=0.9999。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度实验 取对照品溶液连续进样5 次，测得平均峰面积为5037662，RSD =0.18%，表明仪器精密度良好。结果见表1。

2.3.2 稳定性实验 取处理后的白蘑样品分别于0、2、4、6、8、12h 各进样一次，测得平均峰面积为528038，RSD =1.01%，表明在12h 内供试品溶液稳定性良好。结果见表2。

2.3.3 重复性实验 精密称取白蘑柄样品5 份，每份2.5g，按1.2.2 项下方法制备，依方法进行测定，计算出该样品麦角硫因的平均含量为0.055%，RSD =0.90%，表明该方法重复性良好。结果见表3。

2.3.4 加样回收率实验 取已知麦角硫因含量的白蘑柄样品2.5g，分别加入相当于样品中麦角硫因含量的80%、100%、120%的对照品溶液，按1.2.2 项下方法进行处理，供试品溶液进行HPLC 测定。结果显示回收率良好，如表4。

表1 精密度考察结果Table 1 The result of precision tests

表2 稳定性考察结果Table 2 The result of stability tests

表3 重复性考察结果Table 3 The result of repeatability tests

表4 麦角硫因加样回收率结果Table 4 The addition recovery of ergothioneine

表5 多种蘑菇中水分含量的测定(n=3)Table 5 The moisture contents of different mushrooms(n=3)

表6 不同品种及不同部位蘑菇中麦角硫因的含量测定(n=3)Table 6 The contents of ergothioneine in different kinds of mushrooms(n=3)(1)

2.4 样品水分含量测定

按1.2.3 项下测得各样品的水分含量W(%)，结果如表5。

2.5 样品含量测定

按1.2.5 项下测得各样品的麦角硫因含量，结果如表6。

本实验选取了东北地区，天津和山东地区常见蘑菇为原料，并将几种可以明确分辨伞和柄的蘑菇进行分离，分为伞和柄两种部位进行麦角硫因的含量测定，结果发现，不同品种的蘑菇中麦角硫因含量差异较大，只有东北的松蘑中不含有麦角硫因，其余九种蘑菇中均不同程度含有麦角硫因。我们也对能够明确辨识的蘑菇伞和柄分别测定麦角硫因的含量，结果显示同种蘑菇的不同部位中麦角硫因含量也存在差异，尤其白蘑的蘑菇伞中不含有麦角硫因而蘑菇柄中却含有。这可能与麦角硫因在真菌体内合成过程有关，还有待进一步研究。

同时，因各蘑菇样品的水分含量不同，尤其是新鲜的蘑菇中含有大量的水分，在室温下储藏时质量极其不稳定，所以1.2.2 项下称取的蘑菇质量并不能代表其真实质量，所以我们通过测定各样品的水分含量，将各样品的质量折算成不含水分的蘑菇质量，保证了含量测定的真实性、准确性。

3 结论

本实验利用高效液相色谱法建立了麦角硫因的含量测定方法，该方法简便、快速、灵敏。实验中选自天津、山东及东北地区的10 种蘑菇材料，测得其中麦角硫因的含量，含量范围在0.000%～0.280%之间。麦角硫因含量由高到低依次为:榛蘑伞＞金针菇＞口蘑＞鸡腿菇伞＞海鲜菇＞白玉菇柄＞鸡腿菇柄＞白蘑柄＞猴头菇＞平菇＞榛蘑柄＞松蘑、白蘑伞。实验结果为蘑菇的开发利用提供了科学依据。

此外对于含有麦角硫因的蘑菇也可以进一步驯化蘑菇菌种，优化培育条件，可以提高麦角硫因的含量，为其综合开发利用奠定基础。这些仍需要我们科研工作者进行深入研究和探讨。

［1］Tanret C.Sur une base nouvelle retiree du seigle ergote，L-Ergothioneine Compt［J］.Rend Acad Sci，1909，149:222-224.

［2］Hartman P E.Ergothioneine as antioxidant［J］.Methods Enzymol，1990，186:310-318.

［3］Aruoma O I，Spencer J P，Mabmood N.Protection against oxidative damage and cell death by the natural antioxidant ergothioneine ［J］.Food Chem Toxicol，1999，37 (11 ):1043-1053.

［4］Aruoma O I，Whiteman M，England T G，et al.Antioxidant action of ergothionein:Assessment of its ability to scavenge peroxynitrite［J］.Biochem Biophys Res Commun，1997，231(2):389-391.

［5］朱本占，毛莉，范瑞梅，等.天然抗氧化剂麦角硫因保护铜所致DNA 和蛋白质氧化损伤的作用机理［J］.科技通报，2011，56(27):2283-2288.

［6］乔风云，陈欣，余柳青.抗氧化因子与天然抗氧化剂研究综述［J］.科技通报，2006，22(3):332-336.

［7］林陈水，付水星，黎小军，等.一种稀有的天然氨基酸—麦角硫因［J］.氨基酸和生物资源，2006，28(1):63-67.

［8］D l 比赛特.使用包含麦角硫因的个人护理组合物调节哺乳动物的角质组织:中国，200680016867.X［P］.2008-05-07.

［9］李轶群，周念波.麦角硫因的生物学功能及其应用［J］.食品工程，2010，3:26-28.

［10］Xu J，Yadan J C.Synthesis of L-(+)-ergothioneine［J］.Org.Chem，1995，60(20):6296-6301.

［11］Yadan J C，Xu J.Process for the preparation of ergothioneine［P］.US patent:5，438，151.August 1，1995.

［12］周念波，李轶群，殷勤红.氧化铝柱层析从双孢菇菇柄中提取麦角硫因［J］.安徽农业科学，2010，38(27):14842-14843.

［13］何波.日本侧耳的两种甜菜碱型氨基酸衍生物［J］.国外医学中医中药分册，1998，20(6):36-39.

［14］Newton G L，Dorian R，Fahey R C.Analysis of biological thiols-Derivatization with monobromobimane separation by reverse-phase high - performance liquid chromatography［J］.Anal Biochem，1981，114(2):383-387.

［15］Carlsson J，Kierstan M P，Brocklehurst K.A convenient spectrophotometric assay for the determ ination of L-ergothioneine in blood［J］.Biochem J，1974，139(1):237-242.

［16］Elizabeth W.Estimation of ergothioneine in urine by paperpartition chromatography［J］.The Lancet，1949，253(6555):652-654.

［17］Estrada A E，Lee H，Beelman R B，et al.Enhancement of the antioxidants ergothioneine and selenium in Pleurotus eryngii var.eryngii basidiomata through cultural practices［J］.World J Microbiol Biotechnol，2009，25:1597-1607.

［18］Lee W Y，Park E J，Ahn J K.Supplementation of Methionine Enhanced the Ergothioneine Accumulation in the Ganoderma neo-japonicum Mycelia［J］.Appl Biochem Biotechnol，2009，158:213-221.

［19］周念波，朱艳琴，殷勤红.高效液相色谱法测定双孢菇中麦角硫因的含量［J］.食品科技，2010，35(10):271-272，279.

［20］张艳红，陈兆慧，王德萍，等.红枣中氨基酸和矿质元素含量的测定［J］.食品科学，2008，29(1):263-266.

［21］祝美云，王艳萍，王成章，等.用HPLC 法测定富铁锌苜蓿芽氨基酸的含量［J］.食品科学，2007，28(8):438-441.

［22］国家药典委员会.中国药典(一部)［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:附录52.