龙葵果总生物碱的提取研究1）

么宏伟，谢晨阳，吴洪军，冯磊，赵凤臣，张学义

（黑龙江省林副特产研究所，黑龙江省非木质林产品研发重点实验室，黑龙江 牡丹江 157011）

0 前言

龙葵（Soalnum nigrumL.），俗名黑天天，茄科（Solanaceac）茄属龙葵种，一年生草本植物，全国大部分省区均有分布，多为野生杂草。龙葵的药用始载于《本草正义》。中医功用主要包括：清热解毒，利尿降压和祛痰止咳等。含龙葵的复方药物广泛用于治疗各种肿瘤［1］，对肝癌［2－3］、肺癌［4－5］、膀胱癌［6］和胃癌［7］有显著疗效。龙葵果是一种纯天然、绿色、野生的可食用浆果，其潜在的营养价值、药用价值和商用价值，使之具有广阔的国内外市场，从龙葵果中分离出含量高的总生物碱，从而开发出具有较高生物活性的总生物碱制品，不但在医药和食品行业有广阔的应用前景，而且可为我国丰富的龙葵果资源的开发和利用提供一条新途径。

本论文进行龙葵果总生物碱提取研究：（1）采用回流提取发处理方法从对提取时间温度、提取时间、料液比各因素进行研究，确定最佳的工艺；（2）采用微波辅助技术从微波时间、微波温度、乙醇浓度对东北原生种猕猴桃黄酮类化合物的提取工艺进行了优化；（3）采用超临界CO2萃取法中萃取时间、萃取温度、萃取压力三个因素进行了正交试验和分析，确定CO2萃取的最佳工艺参数；（4）比较三种方法提取率的高低，以及各自的优缺点。

1 材料与方法

1.1 试验仪器与材料

1.1.1 试验材料

实验用龙葵全草干燥品，市购，粉碎后过200目筛备用。澳洲茄胺（Solasodnie）标准品（纯度＞95%），MPBiomedieals.Inc；95% 乙 醇、甲 醇 均 为AR级；实验用水为蒸馏水。

1.1.2 试验仪器

ENCOW201旋转蒸发器R系列上海申升科技有限公司；TGL－16G台式高速离心机 湖南星科科学仪器有限公司；SHB－III循环水式多用真空泵 郑州长城仪器厂；AY220电子天平SHIMADZU公司；EZl02微型植物试样粉碎机 黄骅市齐家务科学仪器厂；WP65Dsancle微波反应器 南京申科电器公司；JSM－6460LV 型 扫 描 电 镜 JOEL 公 司；ZE－1自动覆膜仪JOEL公司；756MC型紫外可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司。

1.2 回流提取法提取龙葵果总生物碱的研究

1.2.1 回流提取工艺

提取龙葵果→干燥粉碎→配成乙醇料液→回流提取→过滤→浸提液→离心→浓缩→真空干燥

1.2.2 回流提取法最佳条件的确定

（1）提取时间对提取量的影响。准确称取1g龙葵果粉末，料液比1∶100，60℃水浴，分别提取2、3、4、5、6h 后 冷 却，2500r／min 离 心 10min，定 容100mL，测510nm处吸光值，计算提取量。

（2）提取温度对提取量的影响。准确称取1g龙葵果粉末，料液比1∶100，分别置于40、50、60、70、80℃水浴中提取4h，冷却后，2500r／min离心10min，定容100mL，测510nm处吸光值，计算提取量。

（3）料液比对提取量的影响。准确称取龙葵果粉末，分别配成料液比为1∶60、1∶70、1∶80、1∶90、1∶100的料液，置于60℃水浴中提取4h后冷却，以 2500r／min 离 心 10min，定 容 100mL，测510nm处吸光值，计算提取量。

（4）回流提取法最佳提取条件的确定。为得到回流提取法的最佳提取条件，采用正交试验设计。以提取时间、提取温度和料液比为影响因素，以总生物碱提取量为指标，采用三因素三水平的正交表L9（33）进行试验。

表1 水提取法正交因素水平表

1.3 微波辅助提取法提取龙葵果总生物碱的研究

1.3.1 微波辅助提取法提取工艺

龙葵果→干燥粉碎→配成乙醇浓度为95%的料液→微波辅助提取→过滤→浸提液→离心→浓缩→真空干燥

1.3.2 微波辅助提取法最佳条件的确定

（1）微波温度对提取量的影响。准确称取5g龙葵果粉末，融入100mL乙醇浓度50%（v／v）料液，微波功率100W，时间30min，微波温度分别为20、30、40、50℃。

（2）微波时间对提取量的影响。准确称取5g龙葵果粉末，融入100mL乙醇浓度50%（v／v）料液，微波功率100W，微波温度为30℃，微波时间分别为15、30、45、60min。

（3）乙醇浓度对提取量的影响。准确称取5g龙葵果粉末，融入100mL乙醇浓度分别为40%、50%、60%、70%、80%（v／v）料液，微波功率100W，时间30min，温度30℃。

（4）微波提取法最佳提取条件的确定。为得到微波提取法的最佳提取条件，采用正交试验设计。以微波温度、微波时间和乙醇浓度为影响因素，以总生物碱提取量为指标，采用三因素三水平的正交表L9（33）进行试验。

表2 微波提取法正交因素水平表

1.4 超临界CO2流体萃取法提取龙葵果总生物碱的研究

1.4.1 超临界CO2流体萃取法提取龙葵果总生物碱工艺

龙葵果→干燥粉碎→乙醇热浸提→过滤→浸提液→超临界CO2流体萃取→液态EGB（萃余物）→真空干燥→固态EGB

2.4.2 超临界CO2流体萃取法最佳条件的确定

（1）萃取温度对提取量的影响。选择萃取温度分别为40、50、60、70、80℃，萃取压力25MPa，萃取时间2h。

（2）萃取压力对提取量的影响。选择萃取压力分别为15、20、25、30、35MPa，萃取温度70℃，萃取时间2h。

（3）萃取时间对提取量的影响。选择萃取时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h，萃取压力25MPa，萃取温度70℃。

（4）超临界CO2流体萃取最佳提取条件的确定。为得到超临界CO2流体萃取的最佳提取条件，采用正交试验设计。以萃取温度、压力、时间为影响因素，以总生物碱类化合物提取量为指标，采用三因素三水平的正交表L9（33）进行试验。

表3 超临界CO2流体萃取正交因素水平表

2 结果与分析

2.1 回流提取法提取龙葵果总生物碱结果分析

2.1.1 提取时间对提取量的影响结果

图1 提取时间对提取量的影响

表4 不同提取时间提取量差异显著表

由图1可知，提取量随着提取时间的增加而增加。由表4可知，提取4h与5h提取量最多，较其它处理差异显著，出于成本考虑，因此提取4h提取时间为最佳条件。

2.1.2 提取温度对提取量的影响结果

图2 提取温度对提取量的影响

表5 不同温度时间提取量差异显著表

由图2可知，提取量随着温度的升高而增加。由表5可知，80℃时提取量最大，较其它处理差异显著。因此在80℃条件下进行提取效果最佳。

2.1.3 料液比对提取量的影响结果

图3 料液比对提取量的影响

表6 不同料液比提取量差异显著表

由图3可知，料液比在1∶60～1∶80之间时，提取量随着料液比的增加而增加，当料液比大于1∶80时，提取量呈下降趋势。由表6可知，料液比在1∶70、1∶80时提取量最大，较其它处理差异显著。出于成本考虑，料液比选择1∶80为最佳条件。

2.1.4 回流提取法最佳提取条件结果的确定

表7 回流提取法正交试验表

由正交试验表7可知，三因素极差B＞A＞C，说明影响提取量的主要因素依次为提取温度、提取时间、料液比。处理9提取量最大，因此回流提取法最佳提取条件为提取温度80℃、料液比为1∶80、提取5h，此条件下可提取0.098OD总生物碱。

2.2 微波辅助提取法提取龙葵果总生物碱结果

2.2.1 微波温度对提取量的影响结果

图4 微波温度对提取量的影响

表8 不同微波温度提取量差异显著表

由图4可知，微波温度在20～40℃时，提取量随着温度的升高而增加，微波温度超过40℃，提取量随着温度的增加而减少。由表8可知，微波温度在40℃时提取量最高，较其它处理差异显著。因此，最佳微波温度为40℃。

2.2.2 微波时间对提取量的影响

图5 微波时间对提取量的影响

表9 不同微波时间提取量差异显著表

由图5可知，微波时间在15～45min区间内，提取量随着时间的增加而增加，微波时间大于45min时，提取量随着时间的增加而减少。由表9可知，微波时间在45min时提取量最大，较其它处理差异显著。因此，最佳微波时间为45min。

2.2.3 乙醇浓度对提取量的影响结果

图6 乙醇浓度对提取量的影响

表10 不同乙醇浓度提取量差异显著表

由图6可知，乙醇浓度在40%～60%区间内，提取量随着乙醇浓度的增加而增加，乙醇浓度大于60%时，提取量随着乙醇浓度的增加而减少。由表10可知，乙醇浓度在60%时提取量最大，较其它处理差异显著。因此，最佳乙醇浓度为60%。

2.2.4 微波提取法最佳提取条件的确定

由正交试验表11可知，三因素极差B＞A＞C，说明影响提取量的主要因素依次为微波温度、微波时间、乙醇浓度。处理7提取量最大，因此微波提法最佳提取条件为微波温度30℃、乙醇浓度为60%、微波提取60min，此条件下可提取0.607OD总生物碱。

表11 正交试验结果

2.3 超临界CO2流体萃取法提取龙葵果总生物碱结果分析

2.3.1 萃取温度对提取量的影响结果

图7 萃取温度对提取量的影响

表12 不同萃取温度提取量差异显著表

由图7可知，提取量随着萃取温度的升高而增加。由表12可知，萃取温度在50℃时提取量最高，较其它处理差异显著。因此，最佳萃取温度为50℃。

2.3.2 萃取压力对提取量的影响结果

图8 萃取压力对提取量的影响

表13 不同萃取压力提取量差异显著表

由图8可知，萃取压力在15～25MPa时，提取量随着萃取压力的升高而增加，萃取压力超过25MPa，提取量随着萃取压力的增加而减少。由表13可知，萃取压力在25MPa、30MPa时提取量最高，较其它处理差异显著。出于成本考虑，因此，最佳萃取压力在25MPa。

2.3.3 萃取时间对提取量的影响结果

图9 萃取时间对提取量的影响

表14 不同萃取时间提取量差异显著表

由图9可知，提取量随着萃取时间增加而增加。由表14可知，萃取时间在60min、80min、100min时提取量最大，较其它处理差异显著。出于成本考虑，因此，最佳萃取时间为60min。

2.3.4 超临界CO2流体萃取最佳提取条件的确定

表15 正交试验结果

由正交试验表15可知，三因素极差B＞C＞A，说明影响提取量的主要因素依次为萃取温度、萃取压力、萃取时间。处理8提取量最大，因此萃取提法最佳提取条件为萃取温度50℃、萃取压力30MPa、萃取时间100min，此条件下可提取0.345OD总生物碱。

2.4 各最佳提取方法比较结果分析

表16 不同提取方法提取量差异显著表

由表16可知，各最佳提取方法的提取量差异显著，提取量依次为微波提取法＞超临界二氧化碳萃取法＞回流提取法。因此，微波提取法为最佳提取方法。

3 小结

3.1 回流提法最佳提取条件为提取温度80℃、料液比为1∶80、提取5h，此条件下可提取0.098OD总生物碱。

3.2 微波提法最佳提取条件为微波温度30℃、乙醇浓度为60%、微波提取60min，此条件下可提取0.607OD总生物碱。

3.3 CO2萃取提法最佳提取条件为萃取温度50℃、萃取压力30MPa、萃取时间100min，此条件下可提取0.345OD总生物碱。

3.4 最佳提取方法的提取量差异显著，提取量依次为微波提取法＞CO2萃取法＞回流提法。因此，微波提取法为最佳提取方法。

［1］丁国栋，杨广文，张晓健.龙神注射液治疗中晚期恶性肿瘤临床疗效评估［J］.肿瘤研究与临床，1999，11（2）：123－124.

［2］吕翠霞，李秀荣.清热解毒中药治疗中晚期原发性肝癌的临床与实验研究概况［J］.山东中医药大学学报，1999，23（3）：224－227.

［3］刘国良，李仲瑞.中药体表外贴加化疗治疗肝癌61例临床观察［J］.现代肿瘤医学，1997，5（4）：225－226.

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［5］谢远明，张长富，郭洪欣.加味一贯煎治疗肺癌症106例［J］.陕西中医，2002，23（4）：302－303.

［6］雷相明.中西医结合治疗膀胱癌术后30例［J］.中国民间疗法，1999（1）：216.

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