外界因素对松针中多酚、柚皮素含量的影响1）

邓浩，高波，王文芝，卢卫红＊，王振宇

（1.哈尔滨工业大学 极端环境营养与防护研究所，哈尔滨工业大学 食品科学与工程学院，哈尔滨 150090；2.黑龙江中医药大学 附属第二医院）

近年来研究发现松科植物的体内含有大量的多酚类化合物，具有一系列独特的化学性质和生物活性，统称为松多酚。该类化合物具有抗氧化、清除体内自由基、降血脂、吸收紫外线、抗癌抗肿瘤、消毒杀菌、除臭等多种生理活性；能与蛋白质、生物碱、多糖结合，并可与多种金属离子发生络合反应，多酚中含有酚羟基等多种官能团，可以通过氢键、疏水键或者共价键与高分子化合物接枝、共聚或共混，可以制备出一系列新型先进材料，可广泛应用于食品、医药、化妆品、皮革、化妆品、保健品及高分子材料等领域。柚皮素是柚皮甙的甙元，属于二氢黄酮类化合物。黄酮类化合物的母核结构相似，多数成分脂溶性和水溶性不甚理想，生物利用度低。柚皮素具有抗菌、抗炎、清除自由基、抗氧化、止咳祛痰、降血脂、抗癌抗肿瘤、解痉和利胆、预防和治疗肝病、抑制血小板凝结、抗粥样动脉硬化等作用，可被广泛地应用于医药、食品等领域。

植物多酚生物合成的起始底物为香豆酰－CoA和丙二酰－CoA，而香豆酰－CoA来源于苯丙烷类代谢途径，丙二酰－CoA来源于乙酰－CoA。它们在查尔酮合成酶（CHS）作用下形成查尔酮，由查尔酮异构酶催化查尔酮形成柚皮素，柚皮素作为主要代谢产物分三个途径合成多酚类物质。柚皮素作为多酚合成的必需中间产物，对多酚的合成具有重要的作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

用于探究光照对松多酚和柚皮素含量影响实验样本采集于哈尔滨工业大学二校区内。从不同松树的不同位置剪取松针，并标记为底部阳面、底部阴面、中部阳面、中部阴面。

用于探究营养、激素对松多酚和柚皮素含量影响实验样本采集于实验室土培松树苗。营养条件：大量元素包括硝酸钾3g、硝酸钙5g、硫酸镁3g、磷酸铵2g、硫酸钾1g、磷酸二氢钾1g。微量元素乙二胺四乙酸二钠100mg、硫酸亚铁75mg、硼酸30mg、硫酸锰20mg、硫酸锌5mg、硫酸铜1mg、钼酸铵2mg。分别配置成6、8、10、12L的营养液。标号为营养1、营养2、营养3、营养4。分别浇灌不同组的土培松针，每次100mL，每3天一次。激素条件：称量适量的生长激素（萘乙酸），配置成浓度为20、40、60、80mg／L的溶液。喷洒到生长激素组的松针上，每次10mL，每3天一次。分别标号为激素1、激素2、激素3、激素4。

1.2 实验仪器

SPECORD200紫外可见分光光度计（成都贝斯达仪器有限公司）；R－1002旋转蒸馏仪（郑州长城科工贸有限公司）；FW100高速万能粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）；LDZ5－2离心机（北京医用离心机厂）；SHB循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 没食子酸标准曲线的制定

准确最取标样没食子酸溶液（100μg／mL）0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35mL 于10mL 比色管中，加蒸馏水至2mL，摇匀后加1.0mL福林试剂，4min后加入1.0mL 10%的碳酸钠溶液，75℃水浴下保持15min后测定溶液在765nm处的吸光值。获得标准曲线。标准曲线方程为：

Y ＝0.1704 X －0.042，R2＝0.9996。

1.3.2 柚皮素标准曲线的制定

准确称取0.005g柚皮素标准品，用95%乙醇溶解定容至50mL。分别精密吸取该溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mL 于7个10mL容量瓶中，用95%乙醇定容至刻度，然后在最大吸收波长下以95%乙醇为参比测定各标准稀释液在290nm处的吸光度，绘制标准曲线。计算回归方程：

Y ＝0.0551 X ＋0.033，R2＝0.9994。

1.3.3 样品前期处理

从松枝上采取松针，用剪刀将松针剪细后置于干燥皿中，并做好标记，进行冷冻干燥，直至样品完全干燥后取出，在室温下放置30min后用粉碎机将松针粉碎成粉末，用筛子将粉筛出，备用。

1.3.4 松多酚含量的测定

称量各样本粉末2g，取两份，放入250mL三角瓶中，加入250mL 65%的乙醇，超声辅助提取松多酚和柚皮素。参数设置：提取温度75℃；提取时间45min。将提取液抽滤定容至250mL，取1mL抽滤液，于10mL比色管中，用65%乙醇定容至刻度，准确吸取1mL的松针提取液于10mL比色管中，加蒸馏水至总体积为2mL。加入1.0mL福林试剂后摇匀，4min后加入1.0mL碳酸钠溶液，25℃水浴下保持2h（75℃水浴15min）后测定溶液在765 nm处的吸光度值。将吸光度值代入没食子酸标准曲线方程计算出所测溶液中多酚的浓度，然后算出样品中多酚类成分含量。

1.3.5 柚皮素含量的测定

将超声辅助提取的松针粉末溶液抽滤，得到上清液，用旋转蒸发仪将获得的上清液旋蒸干，得到固体粉末。利用95%的乙醇溶液将固体粉末溶解，装入10mL离心管中，然后进行离心（3500r／min，15min）。离心后记录所得柚皮素溶液的体积。将得到的柚皮素溶液用95%的乙醇溶液稀释一定的倍数，以95%的乙醇溶液为参照，测定各样本稀释液在290nm处的吸光度。将测得的吸光度值代入柚皮素标准曲线方程，得到柚皮素稀释溶液的浓度，最后计算出各样本中柚皮素的含量。

2 结果与分析

2.1 不同时期光照对松多酚、柚皮素含量的影响

将松针从松树的不同部位上采集下来，进行前期处理后，测定各样本中松多酚和柚皮素的含量。不同时期样本中松多酚和柚皮素含量测定结果平均值列于表1中。

表1 松针中松多酚和柚皮素的含量

根据表1数据，对不同时期树1和树2中松多酚含量，作出假设检验，经t检验，P＜0.05，差异显著。随着时间的推移，光照时间延长，光照强度增加，松针中多酚的含量逐渐增加，松针中松多酚含量最高值达到43.06mg／g。说明光照对松多酚的合成具有促进作用。

对不同时期柚皮素含量作出假设检验，经t检验，P＞0.05，差异不显著。随着时间的推移，松针中柚皮素含量变化不显著。柚皮素是多酚合成的中间产物，由于光照促进了多酚的合成，说明光照能促进柚皮素的合成。柚皮素含量没有增加的可能原因是：光照同时能促进柚皮素参与新陈代谢，使部分柚皮素消耗。

2.2 营养和激素对松多酚、柚皮素含量的影响

购买土培松针苗，在不同营养和激素条件下培养，其他外界条件保持一致。培养1个月后，从松树苗上采集松针，进行前期处理后，测定松针中多酚和柚皮素的含量。实验测得结果平均值列于表2中。

表2 松针中松多酚和柚皮素含量

根据表2数据，在营养实验组中：对松针中多酚含量作出假设检验，经t检验，P＜0.05，差异显著。在一定营养浓度范围内，随着营养液浓度的上升，松针中松多酚含量明显增加，松多酚含量最高值为42.21mg／g，说明营养对松多酚的合成具有促进作用。对松针中柚皮素含量作出假设检验，经t检验，P＞0.05，差异不显著。

在生长激素实验组中：各样本中松多酚含量，经t检验，P＜0.05，差异显著。在一定浓度范围内，随着喷洒的生长激素（萘乙酸）浓度的增加，松针的生长速度加快，松针中松多酚的含量增加，最高含量为44.35mg／g。说明生长激素对多酚的合成具有促进作用。松针中柚皮素含量经t检验，P＞0.05，差异不显著。

3 结论

本论文研究了不同外界因素对松针中松多酚、柚皮素含量的影响，通过利用比色法测定不同外界条件培养的松针中松多酚和柚皮素的含量。得到的主要结论如下：

3.1 随着时间的推移，光照时间延长，光照强度增加，松针中多酚的含量逐渐增加。说明光照对松多酚的合成具有促进作用。但松针中柚皮素含量变化不显著。说明光照能促进柚皮素的合成，但同时光照也促进柚皮素的新陈代谢，使部分柚皮素消耗。

3.2 用不同浓度的营养液浇灌松针，发现在一定浓度范围内，随着营养液浓度的上升，松针中的松多酚含量明显增加，说明营养能促进松多酚的合成。随着营养液浓度的上升，松针中柚皮素含量变化不明显。

3.3 使用不同浓度的生长激素（萘乙酸）喷洒松树苗，发现松针的生长速度加快。在一定生长激素浓度范围内，随着生长激素浓度上升，松针中松多酚含量增加，说明生长激素能促进松多酚的合成。在一定生长激素浓度范围内，随生长激素浓度上升，松针中柚皮素含量增加，当达到一定浓度时，松针中的柚皮素含量反而降低，当生长激素浓度为80mg／L时，松针中柚皮素含量最高。

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