鼠骨髓间充质干细胞诱导的成骨细胞与3－羟基丁酸/3－羟基己酸共聚物的体外相容性

马敏先 周祥文 王 永 王 梅 (贵阳医学院附属医院口腔修复科，贵州 贵阳 563003)

口腔种植技术与传统的修复方法相比，由于具有更接近于天然牙的功能和美学修复效果，目前已成为修复牙列缺损或缺失的主要方法之一。然而，许多患者由于缺牙后的生理性吸收、外伤性缺损等因素造成牙槽骨骨量不足，而无法进行口腔种植修复。目前采用的骨组织引导再生术只能修复较小的骨缺损;自体骨移植虽然安全可靠，无免疫排斥，但存在供骨区并发症的可能;异体骨移植能修复较大骨缺损，但存在免疫排斥。组织工程可以通过提取自体细胞体外培养骨组织来修复大段骨缺损，因此已成为口腔种植领域的主要研究方向〔1〕。组织工程的两个重要因素分别是种子细胞和支架材料。骨髓间充质干细胞(BMSCs)由于具有高度自我更新能力及多向分化潜能，而成为最常用的种子细胞之一。支架材料目前以聚乳酸、聚羟基乙酸及其共聚物等为代表的高分子可吸收材料应用最为广泛。3-羟基丁酸/3-羟基己酸共聚物(PHBHHx)因其出色的力学性能、良好的生物相容性和可完全降解性，而在组织工程和医用材料领域备受关注〔2〕。本实验通过SD大鼠BMSCs诱导的成骨细胞与PHBHHx支架材料体外复合培养，采用MTT法检测其体外相容性，从而评估PHBHHx作为骨组织工程支架材料的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验材料 1～2月龄SD大鼠(贵阳医学院动物中心)。L-DMEM(美国Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季清公司)，地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸(美国Sigma公司)。倒置相差显微镜(Nikon)，扫描电镜(贵阳医学院电镜室)。多孔仿生骨支架材料PHBHHx(清华大学化工系研制)。该材料为三维多孔立体结构，孔径200～300 μm，孔隙率90%，且孔间相互连通(图1)。将材料切割成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的正方体块，高温高压消毒备用。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs分离培养及鉴定 采用全骨髓贴壁法分离BMSCs，接种至25 cm2培养瓶中，37℃，5%CO2培养箱内培养。2 d换液一次，待细胞融合至90% ～95%时，1∶2传代。取第三代BMSCs细胞悬液，平均分成3组:CD29组、CD34组、CD90组，孵育、洗涤后待上流式细胞仪。

图1 PHBHHx支架材料(SEM，×1 000)

1.2.2 诱导BMSCs向成骨细胞分化 收集第三代BMSCs分为两组，对照组用完全培养基，实验组用诱导培养基(完全培养基中加入地塞米松10～8 mol/L、β-甘油磷酸钠10 mmol/L、维生素C 50 mg/L)。倒置相差显微镜下观察两者形态。

1.2.3 成骨细胞鉴定 将第三代BMSCs以1×104个/ml细胞密度接种于6孔培养板中(内含处理好的盖玻片)，同时加入含诱导剂的完全培养基，维持培养14 d后进行碱性磷酸酶和茜素红染色。碱性磷酸酶染色 固定液固定3 min，滴加底物应用液，加盖疏水膜，放置湿盒中，避光，37℃孵育15 min，水洗，用复染液染3 min，水洗，拍片记录。茜素红染色 无水乙醇固定10 min，蒸馏水冲洗2次，放入0.1%茜素红-Tris-HCl(pH8.3)染色，37℃染色30 min，蒸馏水冲洗，拍片记录。

1.2.4 成骨细胞与PHBHHx复合培养 制备好的PHBHHx用含诱导剂的完全培养基浸泡，48 h后吸净培养基，将第三代BMSCs以1×105个/孔的细胞密度接种于材料上，同时加入含诱导剂的完全培养基，并置于培养箱。24 h后，将细胞材料复合物转移至24孔培养板中，并补加培养基至1 ml。2 d换液1次。

1.2.5 扫描电镜观察 取培养第9天的细胞/材料复合物用PBS清洗，戊二醛固定，梯度乙醇脱水，干燥，喷金，置于扫描电镜下观察。

1.2.6 MTT法检测成骨细胞在PHBHHx上的增殖活性 实验组将第三代BMSCs以1×105个/孔的细胞密度接种于PHBHHx，对照组将BMSCs以同样密度直接接种于孔板底部，两者同时加入200 μl含诱导剂的完全培养基。1、3、5、7、9 d 后，向两组加入360 μl不含血清的培养基和40 μl MTT(5 g/L)，孵育4 h。弃上清，每孔加入150 μl DMSO，摇匀10 min，然后吸取100 μl加入96孔培养板中，选择490 nm波长，酶标仪测定OD值。每组4个复孔，以上实验重复3遍。

1.3 统计学分析 采 用SPSS11.5软件分析，数据以表示，进行t检验。

2 结果

2.1 BMSCs形态学观察 原代的BMSCs为少量短梭形、星形细胞分散贴壁生长，核呈椭圆形，传代后的细胞为长梭形，分布均匀，排列规则呈流水状(图2)。

2.2 BMSCs的表型鉴定 流式细胞仪检测结果显示CD29、CD90、CD34阳性细胞比率分别为99.1%，88.8%，0.1%，说明所获得的第三代BMSCs纯度较高。

2.3 BMSCs诱导为成骨细胞的形态变化及鉴定 诱导组细胞为三角形、立方形、多边形，体积增大，胞核内出现颗粒状物质，增殖细胞间界限模糊，继而复层生长。对照组细胞仍为长梭形(图3)。碱性磷酸酶染色结果显示，细胞核呈紫色，胞质中出现褐色或咖啡色颗粒。茜素红钙化结节染色细胞汇合后呈多层重叠生长，圆形的矿化结节呈红色(图4)。

2.4 成骨细胞在PHBHHx上的黏附情况 在300倍镜下可见材料上的成骨细胞融合成片状，边缘有许多不规则的突起;而在1 000倍镜下，成骨细胞伸出多个伪足固定于孔隙之间，部分细胞间以突起相互连接，沿孔道呈堆积样生长，排列密集，分布均匀(图5)。

2.5 MTT法检测成骨细胞增殖情况 从接种后的第1天开始，细胞已较好地附着在培养板上。培养前3 d，细胞增殖缓慢，3 d后，细胞进入对数增长期，增殖加速，持续到第7天。7 d后，细胞进入平台期，部分细胞开始凋亡，增殖放缓并略有下降。细胞接种后第3天开始，两组相比差异显著(P＜0.05)。见表1。

图2 原代、第三代BMSCs在倒置相差显微镜图像

图3 诱导组与对照组细胞倒置相差显微镜图像(×100)

图4 成骨细胞染色结果

图5 成骨细胞和PHBHHx支架材料复合培养后扫描电镜

表1 PHBHHx对成骨细胞增殖的影响(OD，，n=12)

表1 PHBHHx对成骨细胞增殖的影响(OD，，n=12)

与对照组比较:1)P＜0.05

组别 第1天 第3天 第5天 第7天 第9天PHBHHx组 0.182±0.001 0.253±0.0031) 0.354±0.0051) 0.589±0.0011) 0.576±0.0011)0.002 0.505±0.001对照组 0.182±0.002 0.242±0.002 0.310±0.011 0.524±

3 讨论

组织工程是通过一定的技术手段将种子细胞和支架材料有机结合起来，在支架材料逐步降解的同时，附着在材料上的细胞不断增殖，最终形成骨组织。因此种子细胞、支架材料已成为组织工程的研究热点。

BMSCs相对特异的表面抗原分别为 CD29、CD90、CD106等，非特异抗原为 CD34、CD45 等〔3，4〕。本实验说明此细胞中造血干细胞含量极少，纯度较高，同时对其进行成骨诱导，通过碱性磷酸酶和茜素红染色呈阳性结果，可以说明所培养的细胞为BMSCs。

本实验选用的PHBHHx是以HB(3-羟基丁酸酯)单体为主要成分，含有少量HHx(3-羟基己酸酯)单体的第三代PHAs(聚羟基脂肪酸酯)，是硬度和韧度都有良好的热塑性材料〔5〕。同时，由于其最终分解为CO2和水，pH呈弱酸性，所以体内植入后炎症反应发生率极低〔6〕，是近年来颇受关注的生物可降解材料。根据实验结果发现成骨细胞在PHBHHx支架材料上能较好地黏附和增殖。考虑其原因可能为:微米级的孔径可以为细胞的机械性刺激感受器提供合适的压力和张力，有利于细胞增殖和黏附〔7，8〕;三维多孔支架材料的立体结构更有利于细胞吸收营养物质和排出代谢产物，同时也为细胞生长、增殖提供宽敞空间。7 d后成骨细胞增殖放缓并略有下降，其原因可能是:培养板中材料大小有限，不能为不断增殖的细胞提供更多的生长空间，代谢废物积聚较多，使部分细胞开始衰老、凋亡。PHBHHx是一种既疏水又不带电荷的材料，实验通过用含诱导剂的完全培养基浸泡支架材料的方法，提高材料的亲水性，结果发现:材料上的成骨细胞表面光滑、增殖较快，说明经含诱导剂的完全培养基浸泡后的材料能模拟细胞的体外生长环境，有利于细胞的黏附和增殖。

我们将进一步对PHBHHx何时植入裸鼠体内及移植到负重部位后对其性状和细胞的影响等方面进行研究。PHBHHx与成骨细胞有良好的体外相容性，是一种性能优良的骨组织工程支架材料，但其应用于骨组织工程的有效性，还有待于体内实验的进一步探讨。

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