去壁低渗法制备无融合生殖甜菜M14 染色体标本

刘丽萍 ，王 艳

(黑龙江大学a.农业微生物技术教育部工程研究中心;b.黑龙江省普通高等学校分子生物学重点实验室;c.农业资源与环境学院，黑龙江 哈尔滨150080)

0 引 言

为了探明无融合生殖甜菜单体附加系M14 品系高频传递的原因和机理，本文在压片法及子房透明技术的基础上，应用去壁低渗法制备无融合生殖甜菜单体附加系M14 的染色体标本，提高了对附加的1 条白花甜菜染色体的识别效率。

去壁、低渗法是陈瑞阳对中国果树及野生近缘植物染色体标本的研究改良技术，对栽培植物的遗传育种以及对世界栽培植物的起源与演化都起着重要的理论和指导意义。植物染色体研究在三、四十年代起过先驱作用，但50 年代后与动物染色体研究相比发展缓慢［1］。近年来，由于染色体技术的不断发明和完善，使涉及以染色体为基础细胞生物学、遗传学、染色体工程学等领域都取得了长足的进展［2-5］。

无融合生殖是指不经过雌雄配子融合而产生种子的一种特殊生殖方式，能使基因型的杂合性得以保持，从而固定杂种优势，对作物育种具有重要的意义［6-9］。我院无融合生殖甜菜研究于1988 年开始进行栽培甜菜与野生白花甜菜的种间杂交工作。以栽培甜菜为母本，白花甜菜为父本进行杂交，获得真实杂种VC88-1(VVCC、2n=4χ=36)。利用栽培甜菜回交产生带有白花甜菜的单体附加系，获得了栽培甜菜附加一条白花甜菜第9 号染色体的M14 单体附加系系列［10-12］，从而将携带无融合生殖基因的一条白花甜菜染色体转移到栽培甜菜。使原来只进行有性生殖的栽培甜菜可以高效表达无融合生殖特性［13-14］，并可以通过母本95%以上高频传递后代。经形态学和细胞学鉴定［15］，发现甜菜单体附加系M14 具有有性生殖与二倍体孢子生殖特性，为兼性无融合生殖体［16］。甜菜课题组每年春天都以镜检的方式对染色体传递率进行检查并分析。镜检方法一直使用常规的压片法［17］，其速度快洁、方法简便易行，即便如此，压片法也只是停留在染色体计数水平。

本实验应用去壁低渗法通过荧光显微技术可以快速找到附加的一条白花甜菜第九号染色体，它常常游离于栽培甜菜染色体之外，使本来难以分辨的那条附加的白花甜菜染色体更加易于识别与分离。为无融合生殖甜菜的染色体微分离、微克隆、Fish 荧光原位杂交等提供了前提条件和技术保障。

1 实验器材及试剂

1.1 实验器材

显微镜(具有照相设备);培养箱(室温至60 ℃);蒸馏水重蒸设备;冰箱(0 ℃);超净台;载玻片;眼科镊子;保安刀片;磨口三角瓶(50 ～100 mL);移液管(10～20 mL);移液器;烧杯(50、100 mL);试剂瓶(125、250、500 mL);刻度滴管(1、2 mL);酒精灯;普通玻璃板20 cm×20 cm;牙签;5 mL 青霉素瓶。

1.2 试 剂

Giemsa 母液配制。0.5 g Giemsa 粉加33 mL 优质丙三醇于研钵中，充分研磨1 h→放入56 ℃温箱2 h，再加入33 mL 甲醇(GR)混匀装瓶备用(储存的时间越长越好)。

Giemsa 染色液。100 mL 磷酸缓冲液加入3 ～5 mL Giemsa 母液(用前现配)。

磷酸缓冲液。A 液［0.067 mol/L 磷酸二氢钾］:称磷酸二氢钾49.118 g 加蒸馏水定溶至1 000 mL;B液［0.067 mol/L 磷酸氢二钠］:称磷酸氢二钠9.467 g加蒸馏水定溶至1 000 mL。

混合酶液。纤维素酶、果胶酶各0. 5 g，加入20 mL 无菌水即为2.5%的混合酶液(冰箱保存，不宜过久)。实验材料与酶液的体积比控制在1 ∶20 ～1 ∶50。酶解的材料经蒸馏水冲洗数次并浸泡30 min，除掉固定液。酶解时间:0.5 ～2.0 h。

前低渗。用滴管吸去处理液，直接换入0. 075 mol/L 氯化钾溶液致使细胞膨大，然后滴片。

2 材料与方法

2.1 实验材料

无融合生殖甜菜M14(2n =18 +1，附加一条白花甜菜第9 号染色体)。取室内培养的根尖做试材。

2.2 实验方法

2.2.1 根尖培养及固定

将甜菜种子用70%乙醇浸泡1 ～2 min→0.001 L汞浸泡10 min→用无菌水洗3 ～4 次→在无菌水中浸泡24 h 后，将种子平铺于培养皿中，盖上一层纱布，于25 ℃温箱中培养。每天早晚更换2 次水。试验材料可以在实验室内随时培养。取样部位根尖分生区。甜菜根尖小，切取根尖1 ～2 mm 长进行预处理，用0.2 mmol/L 8-羟基喹啉处理2 ～4 h，蒸馏水洗2 次。经前低渗的材料，用甲醇∶冰醋酸(3 ∶1)的卡诺固定液固定，固定时间如果超过4 h，可将材料转入70%酒精中长期保存。

2.2.2 涂片法和滴片法制备染色体标本

将预处理过2 h 的实验材料进行前低渗(0.075 mol/L KCl 溶液)使细胞膨大，用2.5%混合酶液酶解0.5 ～2 h，去掉细胞壁，再进行后低渗，后低渗液用重蒸水将实验材料反复处理2 ～3 次。

涂片:将处理好的材料用3 ∶1 的卡诺固定液固定20 ～30 min 后涂片，火焰干燥后用已经配制好的Giemsa 染色液染色，镜检观察。

滴片:将后低渗的材料制备成细胞悬液:先用(3 ∶1)卡诺固定液固定→去沉淀，制成细胞悬液→去上清后再制成细胞悬液，用移液器将细胞打散，距离载玻片约0. 33 m 高度进行垂直滴片，火焰干燥后用Giemsa 染色，镜检观察。

3 实验结果与分析

该技术操作程序简单、快速、省时，实验材料的准备室内即可完成。实验结果表明染色体分散效果良好，利用Olympus-BX51 型荧光显微镜可以清晰地观察到无融合生殖甜菜分散效果良好的分裂相。实验材料:根尖的分裂相不如心叶多。

滴片法(见图1)较凃片法(见图2)观察到的视野更加清爽、干净。从图1 能观察到染色体自然裸露的杂合状态——附加的一条白花甜菜染色体游离于栽培甜菜18 条染色体之外，更加易于识别分辨与分离。

图1 溶片法制备染色体标本 图2 涂片法制备染色体标本

4 结 语

实验过程中必须注意的是:清洁无污染，制片在无菌操作室进行，以便对染色体进行后续操作。载玻片清洗灭菌消毒后置于载片盒内存放于－20 ℃冰箱保存备用。先固定后酶解，后低渗时间要充足，甜菜组织经过低渗之后，细胞经过长时间的浸泡会吸水膨胀使细胞更加充盈饱满，滴片时要注意高度垂直、有力度，使细胞滴落到载片后染色体达到自然散开的状态。另外实验材料与酶液的体积比要控制在1 ∶20 ～1 ∶50 之间。如需长期保存可用丁香油封片。本实验能够对无融合生殖甜菜染色体进行后续分离及Fish 荧光原位杂交，对无融合生殖甜菜的深入研究具有重要意义。

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