Cullin-1和Skp2在鼻咽癌及癌前病变组织中的表达

汪芸王书芹 周小军 王静 毕超 禤瑞霞 陈钰炜 卢金文 包贵贤

Cullin-1和Skp2在鼻咽癌及癌前病变组织中的表达

汪芸★王书芹 周小军 王静 毕超 禤瑞霞 陈钰炜 卢金文 包贵贤

目的 探讨细胞周期蛋白Cullin-1（Cul-1）和S期激酶相关蛋白2（Skp2）在鼻咽癌及癌前病变组织中的表达及意义，同时对比它们在鼻咽癌及癌前病变组织中的表达水平，比较二者的分布情况，找出其差异性及相关关系。 方法 应用免疫组化方法检测Cul-1和Skp2蛋白在20例分化型癌、20例未分化癌和20例鼻咽癌前病变中的表达。 结果 在20例分化型癌、20例未分化癌和20例鼻咽癌前病变中Cul-1的平均阳性表达率分别为76% 、77%、54%；阳性表达值分别为1.63±0.7、1.62±0.68、1.15±0.64，Cul-1在2种鼻咽癌中的表达高于癌前病变，差异有统计学意义（P＜0.05），2种鼻咽癌之间无差异；Skp2在20例分化型癌、20例未分化癌和20例鼻咽癌前病变中的平均阳性表达率为32%、41%、33%，平均阳性表达值分别为0.53±0.49、0.82±0.54、0.72±0.43，无统计学差异。对20例分化型鼻咽癌标本Cul-1、Skp2阳性表达值进行相关关系分析，两者相关性不显著。 结论 Cul-1参与了鼻咽癌发生、发展，Skp2则可能参与了鼻咽癌的发生过程，它参与的细胞周期调节可能是鼻咽癌发生的早期事件；两种蛋白因子在细胞周期调控中的关系有待进一步验证。

鼻咽癌；癌前病变；Cul-1；Skp2

肿瘤是细胞生长失控产生的新生物，细胞分化、凋亡的异常都参与了肿瘤的发生、发展，其中细胞周期的紊乱是最主要的发生机制。细胞周期蛋白（cullin-1，Cul-1）参与肿瘤发生、发展过程[1]，S期激酶相关蛋白2（S-phase kinase associated protein 2，Skp2）参与了细胞周期多个环节的调控[2]。因为其重要性，大量实验研究从蛋白和基因水平探索细胞周期调控的各个环节，希望能从细胞周期的调控中找到鼻咽癌发生、发展、演进的原因，为其预防、诊断治疗提供新线索。

1 材料与方法

1.1 病例样本

取我院2007年至2012年病理确诊为鼻咽癌的活检标本40例，其中病理组织学类型为分化型非角化性鼻咽癌的20例，诊断为未分化型鼻咽癌的20例，取确诊为癌前病变的活检标本20例，鼻咽癌及癌前病变的诊断标准按照国家抗癌协会制定的标准执行[3]，所有标本均作3 μm连续切片。

1.2 主要试剂

Skp2（ZM-0454）鼠抗人单克隆抗体，克隆号1G12E9，抗原修复液1 mM EDTA（pH9.0）购自中杉金桥生物技术有限公司；Cul-1（产品编号：RAB-0513）兔抗人多克隆抗体（浓缩液）、抗体稀释液（产品编号：ABD-0030）；免疫组化试剂盒：即用型快捷免疫组化MaxVisionTM2试剂盒（鼠/兔）（产品编号：KIT-5920/5930），均由福州迈新生物技术有限公司提供。

1.3 方法

Cul-1的染色方法：利用人正常扁桃体组织标本作为阳性对照，用PBS代替一抗作空白对照，Cul-1兔抗人多克隆抗体浓缩液以1∶50的比例，用抗体稀释液稀释后使用，现配现用。Skp2的染色方法：利用本院病理检查确诊为乳腺癌的组织标本作为阳性对照，用PBS代替一抗作空白对照。抗原修复：Skp2鼠抗人单克隆抗体采用碱性修复方法，即1 mM EDTA（pH 9.0）高压热修复方法。

即用型快捷免疫组化MaxVisionTM2试剂盒（鼠/兔）由福州迈新生物技术公司提供，免疫组化染色步骤严格按照试剂盒说明的染色步骤操作（说明书编号：40461a）。

1.4 判断标准及统计方法

Skp2蛋白和Cul-1蛋白的表达均以细胞核中出现棕黄色颗粒作为阳性细胞。在光学显微镜400倍视野下，每个切片随机选取5处视野，辨别阳性细胞和阴性细胞并计算每个视野的阳性表达率。计算方法：先数出5处高倍视野中阳性细胞和阴性细胞总数，阳性表达率=阳性细胞数/（阳性细胞数+阴性细胞数）×100%。同时对每张切片的阳性表达染色强度进行评分，阴性为0分，浅黄色1分，深黄色2分，黄褐色为3分。阳性表达率×染色强度分值=阳性表达值[4]。

用SPSS19.0软件系统进行数据处理，对Skp2和Cul-1在鼻咽癌及癌前病变标本中的阳性表达值以t检验进行统计分析，并进行每两组之间的比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。相关关系采用Pearson Correlation Coefficient（PCC）方法。

2 结果

Cul-1蛋白在分化型癌、未分化癌及癌前病变中的平均阳性表达率分别为76%、77%、54%；平均阳性表达值分别为1.63±0.7、1.62±0.68、1.15±0.64，Cul-1蛋白在两种类型鼻咽癌中的表达均高于癌前病变，差异有统计学意义（P＜0.05），而在两种类型鼻咽癌之间，统计无差异。

Skp2蛋白在分化型癌、未分化癌及癌前病变中的平均阳性表达率分别为32%、41%、33%，阳性表达值分别为0.53±0.49、0.82±0.54、0.72±0.43；Skp2蛋白在两种类型鼻咽癌及癌前病变中的阳性表达值两两比较均无统计学差异（P＞0.05）。

在2种类型鼻咽癌及癌前病变的同一样本配对资料中，比较Cul-1和Skp2阳性表达值，计算Pearson相关系数定量分析两组之间的阳性表达，其结果在0.05 水平（双侧）上均无显著相关。Cul-1和Skp2在鼻咽癌及癌前病变中的表达，见图1。

3 讨论

图1 Cul-1和Skp2在鼻咽癌及癌前病变中表达Figure 1 Expression of Cul-1 and Skp2 with nasopharyngealcarcinoma and precancerous lesion

Skp2是DNA复制所必需的人类F-box蛋白家族中一员，在许多细胞周期相关蛋白的泛素依赖性蛋白水解途径中起到特异性识别底物的作用, 从而参与细胞周期的调控[5～6]。Skp2 和Cul-1 所组装的蛋白复合体称为SCF（Skp1-Cul-1-F box protein），SCF复合物是泛素与蛋白底物结合所需的第三个酶，为泛素—蛋白酶体途径的限速酶，参与许多细胞周期调控因子的泛素依赖性蛋白水解作用，它介导的泛素化降解途径对细胞周期的调控起着重要作用，这种调控作用的失常常常与肿瘤的发生密切相关，而且，这一事件主要发生在该复合体的Cul-1亚基上，Cul-l蛋白在整个泛素连接酶复合物中起着一个类似模板的作用，其结构变化会引起SCF活性的变化，使许多底物蛋白降解水平发生改变。本实验中，Cul-1在两种类型鼻咽癌中的表达均高于癌前病变，证实Cul-1在鼻咽癌发生、发展过程中参与作用，而且是鼻咽上皮癌前病变发展成为鼻咽癌的质变过程中的重要参与因子，这一作用可能是持续的，不是体现在静息期（G0期）到有丝分裂期（G1期）的转换，而是重点参与了鼻咽上皮细胞G1期到G0期的转变，Cul-l蛋白失去终止子活性，受到增生刺激的上皮细胞的有丝分裂无法正常停止，从而使细胞进入异常增生状态，导致鼻咽上皮恶性肿瘤发生，可见Cul-l具有某种癌基因蛋白的性质，不过尚需要进一步的研究加以确定[7～10]。

Skp2在鼻咽癌中的表达明显高于慢性鼻咽炎[11]，在本例研究中Skp2在鼻咽癌与癌前病变中的表达无显著差异性，由此引出的推论：在鼻咽慢性炎症转变为癌前病变和癌的过程中，鼻咽上皮细胞从良性增生转变为异型增生，细胞中Skp2蛋白的表达也发生了变化，Skp2可能参与了鼻咽癌的发生过程，它参与的细胞周期调节可能是鼻咽癌发生的早期事件。本例研究中没有对Skp2在慢性鼻咽炎中的表达进行研究，因此以上推论还需要进一步验证。

Cul-l作为细胞周期调控的上游因子，其变化必然导致一系列下游因子的转变，从而全方位启动细胞的恶性转变，但是在本实验中，Cul-l与Skp2在两种类型鼻咽癌与癌前病变的相关性统计中显示无差别，这一结果需要进一步验证。

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The expression of Cullin-1 and Skp2 within nasopharygeal carcinoma and precancerous lesion

WANG Yun★, WANG Shuqin, ZHOU Xiaojun, WANG Jing, BI Chao, XUAN Ruixia, CHEN Yuwei, LU Jinwen, BAO Guixian
(Department of Pathology, Hospital of Tranditional Chinese Medicine of Zhongshan, Guangdong, Zhongshan 528400, China)

Objective To detect the expression of Cullin-1 (Cul-1) and S-phase kinase associated protein 2 (Skp2) in the tissues of nasopharyngeal carcinoma (NPC) and precancerous lesion, and elucidate the relationship between them. Methods Immunohistoehemical methods were taken to detect the expression of Cul-1 and Skp2 in the tissues taken before treatment among 20 differentiated carcinoma patients, 20 undifferentiated carcinoma patients, and 20 precancerous lesion patients. At last, the relationship between the expression of these protein was analyzed. Results The positive expression rates of Cul-1 in the tissues of differentiated carcinoma, undifferentiated carcinoma and precancerous lesion were 76%, 77% and 54%, respectively. The expression value were 1.63±0.7, 1.62±0.68, 1.15±0.64, respectively. The differences between differentiated carcinoma and precancerous lesion, undifferentiated carcinoma and precancerous lesion were statistically significant (P＜0.05). The positive expression rates of Skp2 in the tissues of differentiated carcinoma, undifferentiated carcinoma and precancerous lesion were 32%, 41%, 33%, respectively. The expression value were 0.53±0.49, 0.82±0.54, 0.72±0.43, and there were no difference between them. To analyze the expression of Cul-1 and Skp2 in 20 differentiated carcinoma, which had no significant correlation. Conclusion Cul-1 and Skp2 protein were involved in the occurrence and development of human nasopharyngeal carcinoma. And the Skp2 participated in cell cycle regulation that may be an early event of nasopharyngeal carcinoma. The relationship between Cul-1 and Skp2 in cell cycle regulation need further validation.

Nasopharyngeal carcinoma; Precancerous lesion; Cullin-1; Skp2

国家自然科学基金（81072847）；中山市卫生局医学科研立项（J2011081）

中山市中医院病理科，广东，中山 528400

★通讯作者：汪芸，E-mail:310355081@qq.com