真菌多糖对氧自由基的清除作用

朱月,马金莲

（赤峰学院生命科学学院，内蒙古赤峰024000）

真菌多糖对氧自由基的清除作用

朱月,马金莲

（赤峰学院生命科学学院，内蒙古赤峰024000）

本文以真菌多糖对氧自由基的清除作用为论题，围绕真菌多糖对氧自由基清除作用方法的研究、真菌多糖对氧自由基的清除作用及清除能力三个方面进行了阐述.

真菌多糖；氧自由基；清除作用；清除能力

氧自由基又称游离基，是具有未配对的电子的氧原子、原子团或分子.包括超氧阴离子自由基（O2-·）、羟自由基（· OH）、过氧化氢（H2O2）、单线态氮（1O2）、氢过氧自由基（（HOO·）、烷氧自由基（RO·）及烷过氧自由基（ROO·）等.

氧自由基是生物体代谢的中间产物.如：机体细胞内存在于线粒体内的呼吸链在电子传递过程中，伴随着氧化磷酸化作用而生成ATP.但是在电子传递过程中也有电子漏出现象，所漏出的电子使氧生成自由基.线粒体中大约有1%～3%的氧可形成自由基.白细胞和多形核白细胞在吞食外来异物和细菌过程中产生呼吸爆发时，也可以释放大量氧自由基[1]，此外外界环境中的阳光辐射、空气污染、吸烟、农药等都会使人体产生更多的氧自由基.

氧自由基活性较强，通常称之为活性氧.在正常的生理条件下生物体内氧自由基的产生与清除保持相对的平衡状态，使氧自由基发挥其特定的生理作用.但当氧自由基过量时对人体和动物体正常细胞和组织会造成损坏，并能引发多种疾患[2].越来越多的证据表明：衰老、人体免疫力下降、心脏病、老年痴呆症、帕金森综合症、肿瘤、癌症、炎症、关节炎等疾病都与自由基有关[3].随着自由基与衰老和疾病关系的研究，也引起诸多学者对氧自由基清除剂研究的关注.并发现在一些植物、大型真菌等生物体内提取的多糖是很好的自由基清除剂.

本文以真菌多糖对氧自由基的清除作用为论题，围绕真菌多糖对氧自由基清除作用方法的研究、真菌多糖对氧自由基的清除作用及清除能力三个方面进行阐述.目的是为从事该方面研究的同行们提供较直接和快捷的研究方法参考；提升人们对真菌多糖的药用价值、保健价值的认识，为食用菌资源的开发与利用提供参考.

1 真菌多糖对氧自由基清除作用方法的研究

1.1 真菌多糖对羟基自由基（·OH）清除作用研究的方法

1.1.1 H2O2-Fe2+-邻二氮菲体系[4]-[7]

研究表明，在H2O2-Fe2+-邻二氮菲体系中，Fe2+既可与H2O2作用产生羟自由基(·OH)，也可与邻二氮菲反应生成Fe2+-邻二氮菲配合物，该配合物在536nm波长处有最大光吸收.如果Fe2+-邻二氮菲配合物被体系中产生的·OH氧化生成Fe3+-邻二氮菲，会导致Fe2+-邻二氮菲的生成减少或消失，在536nm波长处测得的光吸收值减弱或消失.向体系中加入真菌多糖，反应一段时间后，在536nm处测定光吸收值，若光吸收值降低不明显或有升高，说明体系中游离的· OH减少，对Fe2+-邻二氮菲的氧化作用降低或作用消除.因此，依据加入真菌多糖前后光吸收值的变化来判断真菌多糖是否有清除作用.清除能力的大小用清除率来表示.

1.1.2 H2O2-Fe2+-水杨酸体系[8]-[10]

H2O2-Fe2+-水杨酸体系中Fe2+与H2O2作用产生的羟自由基(·OH)与水杨酸相遇生成有色的2.3二羟基苯甲酸. 2.3二羟基苯甲酸在510nm波长处光吸收值最大.向体系中加入某一种真菌多糖后，测定光吸收值，如果测得的光吸收值减小，说明二羟基苯甲酸减少.这是由于真菌多糖对羟自由基的清除作用所致.因此可通过加入真菌多糖前后颜色的变化来反映体系中的羟自由基浓度，并通过测定光吸收值的变化计算真菌多糖对羟自由基的清除率，依此判定某种真菌多糖对羟自由基是否有清除作用及清除能力的强弱.

1.1.3 H2O2-Fe2+-甲基紫反应体系[11]

构建H2O2-Fe2+-甲基紫体系，体系中的甲基紫在酸性溶液中呈现紫色,在578nm处有最大吸收光.当体系中产生的·OH与甲基紫发生亲电加成反应时，·OH容易进攻甲基紫的-C=C-基团，二者产生反应使甲基紫褪色，导致甲基紫的吸光值降低.如果向体系中加入真菌多糖后，体系的颜色有所加深，测得的光吸收值增加，说明·OH减少，体系中的亲电加成反应减弱，游离的甲基紫增多.因此可利用加入真菌多糖前后溶液吸光度值、颜色的变化来评价所加入的真菌多糖是否对·OH有清除作用，并通过清除率的大小来判断和比较真菌多糖清除能力的强弱.

1.1.4 EDTANa2-Fe2+-H2O2-番红体系法[12]

EDTANa2-Fe2+-H2O2-番红体系中的番红在519nm处有最大光吸收值，体系中产生的羟自由基可特异地使番红褪色.向该体系中加入某一种真菌多糖后，根据多糖加入前后光吸收值变化来判断羟自由基是否被清除.以计算的清除率判断真菌多糖对羟自由基的清除能力.

1.2 真菌多糖对超氧阴离子自由基（O2-.）清除作用研究的方法

真菌多糖对超氧阴离子自由基（O2-·）清除作用研究的方法日前有报道的是:“邻苯三酚自氧化法”,“氮蓝四唑(NBT)光照法”,“PMS-NADH体系还原NBT法”,“肾上腺素自氧化法”,“黄嘌呤一黄嘌呤氧化酶法,碱性二甲基亚砜发光法”.资料显示，研究中多采用的是“邻苯三酚自氧化法”.

1.2.1 邻苯三酚自氧化法[13]

邻苯三酚在弱碱性条件下可发生自氧化反应，产生超氧阴离子自由基（O2-·），该自由基可生成带色的中间产物，中间产物在325nm波长处具有强烈的光吸收能力.光吸收值的大小伴随着中间产物数量的积累而增加.并且在反应初始的4min范围内，光吸收值的大小与反应时间呈良好的线性关系.根据邻苯三酚自氧化特性，构建自氧化反应体系，在4min内，每间隔30s测定一次光吸收值并加以记录.以时间为横坐标，光吸收值为纵坐标，求直线方程，计算自氧化速率（每分钟光吸收值变化）.以同样的方法测定并计算加入一定浓度多糖后的自氧化速率.如果向自氧化体系中加入某一种真菌多糖后，测得的光吸收值随着反应时间的延长而减少，说明体系中超氧阴离子自由基（O2-·）减少.证明真菌多糖对超氧阴离子自由基具有清除作用.清除率的大小判断其清除能力.

1.2.2 氮蓝四唑(NBT)光照法[14]

NBT-光照法体系中，核黄素和四甲基乙二胺在光照条件下可产生超氧阴离子自由基（O2-·），氮蓝四唑(NBT)与O2-·反应生成单甲腙（黄色），继而还原生成二甲腙，它是一种蓝色物质，在560nm下有最大光吸收.加入超氧阴离子自由基（O2-·）清除剂时，可以使超氧阴离子自由基与H+结合生成H2O2和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲腙生成速度减慢.故可以通过测定560nm处值和颜色的变化来评价清除剂对（O2-·）的清除作用.如果所加入的清除剂用真菌多糖来代替，并有同样的现象与变化，说明真菌多糖对超氧阴离子自由基（O2-·）有清除作用.

1.2.3 PMS-NADH体系还原NBT法[15]

N-甲基吩嗪甲基硫酸盐（PMS）-还原性辅酶Ⅰ（NADH）体系中，NADH氧化产生的超氧阴离子自由基还原氮蓝四唑（NBT）为蓝色物质，该物质在560nm波长处有最大光吸收值.依据该原理构建由磷酸缓冲液（0.1mol.L-1,pH7. 4）、NADH、PMS、NBT组成的PMS-NADH体系，在室温下反应一定时间，使体系中产生的超氧阴离子自由基还原NBT生成蓝色物质，测蓝色生成物的光吸收值.如果向体系中加入一定量的真菌多糖，所测得的光吸收值低于未加多糖前体系所测得的光吸收值，说明蓝色生成物减少，体系中生成的超氧阴离子自由基被加入的真菌多糖在不同程度上被清除.根据光吸收值的变化计算真菌多糖对超氧阴离子自由基的清除率，以判断其清除能力.

图1 银耳多糖对羟自由基的清除作用

图2 灵芝多糖对羟自由基的清除作用

图3 银耳多糖对超氧阴离子自由基的清除作用

研究表明在邻苯三酚自氧化体系中加入不同浓度的真菌多糖，其多糖对体系中产生的超氧阴离子自由基具有清除作用.颜军等[16]研究发现银耳多糖对超氧阴离子自由基的数为0.9816.当银耳多糖对羟自由基的清除率达50%时，所需的多糖浓度为0.116mg.mL-1.周海华，马海乐[17]采用同样的方法研究云芝多糖发现在1-5 mg.mL-1浓度范围内对羟自由基的最大清除率是48.55%.

张钰，章克昌[18]对超滤浓缩法提取的灵芝多糖采用Fenton反应体系研究灵芝多糖对羟自由基的清除作用，研究结果（见图2）表明，灵芝多糖对羟自由基具有清除作用，相关系数为0.9359.量效关系较好.清除率达50%时的灵芝多糖浓度为1.561mg.ml-1

李海平等[19]研究表明滑菇多糖对羟基自由基（·OH）具清除作用，滑菇多糖（PNP）对·OH的EC50时的多糖浓度为0.14 mg.mL-1；王宗君[20]等研究表明茶树菇多糖也具有清除· OH的作用，且在一定范围内清除率与多糖的用量存在一定的量效关系.在低浓度时，随着浓度的增加，清除率有显著提高，当0.5%多糖的浓度清除率就可以达到74.9%；1.0%多糖浓度清除率达到将近90%；其后再增加多糖的浓度，对· OH的清除率提高不大.

2.2 不同真菌多糖对超氧阴离子自由基（O2-·）的清除作用

2 不同真菌多糖对氧自由基的清除作用

2.1 不同真菌多糖对羟基自由基（·OH）的清除作用

颜军等[16]，采用H2O2-Fe2+-水杨酸反应体系研究真菌多糖对羟自由基的清除作用发现，银耳多糖对羟自由基具有清除作用.清除能力随着银耳多糖浓度的增加而增加.将其试验结果作直线图，表明：在所设定的银耳多糖浓度范围内，多糖浓度与清除率呈良好的线性关系（见图1），相关系清除能力随着银耳多糖浓度的增加而增加，在所设定的银耳多糖浓度范围内，多糖浓度与清除率呈良好的线性关系（见图3）.当银耳多糖对超氧阴离子自由基的清除率达50%时，所需的多糖浓度为0.264mg.mL-1.

秦恩华[21]研究表明：茶薪菇多糖对邻苯三酚自氧化体系中产生的超氧阴离子自由基也具有清除作用.清除能力随着茶新菇多糖浓度的增加而增加，在0.1-0.9mg.mL-1浓度范围内，多糖浓度与清除率呈良好的线性关系（见图4）.其清除率达50%时所需茶新菇多糖浓度是1.515 mg.mL-1.

图4 茶薪菇多糖对超氧阴离子自由基的清除作用

周海华，马海乐[22]在NADH-PMS-NBT体系中加入不同浓度的云芝多糖，其多糖对体系中产生的超氧阴离子自由基有清除作用，在0.01-0.1mg.mL-1浓度范围内，云芝多糖浓度与清除率呈良好的正相关.对超氧阴离子自由基的清除率达50%时所需要的多糖浓度为0.0952 mg.mL-1.

3 不同真菌多糖对氧自由基清除能力的比较

3.1 不同真菌多糖对羟自由基清除能力的比较

盛伟等[23]采用H2O2-Fe2+-水杨酸反应体系对白灵菇、杏鲍菇和阿魏菇三种真菌多糖对羟自由基的清除作用进行了研究.研究结果表明：三种真菌多糖对羟自由基均有清除作用，清除能力与多糖浓度也呈量效关系.在相同的浓度条件下，白灵菇对羟自由基的清除作用明显高于杏鲍菇和阿魏菇.三种真菌多糖在所研究的浓度范围内，均在0.25 mg. mL-1时表现出最大清除率，分别是48%、31.5%、25%左右.证明三种真菌多糖对羟自由基的清除能力不同，清除能力按其大小依次为白灵菇、杏鲍菇、阿魏菇.

魏磊等[24]对野生的鸡油菌、变绿红菇、蜜环菌、棕灰口蘑四种野生食用菌多糖对羟自由基的清除作用的研究发现，四种野生食用菌对羟自由基都有很好的清除能力，10mg. mL-1时清除率最大，均达到95%以上.其中鸡油菌达到99.60%.清除率达50%时所对应的四种野生食用菌的多糖浓度依次为1.12、1.21、0.78、0.65mg.mL-1.清除能力大小依次为棕灰口蘑、蜜环菌、鸡油菌、变绿红菇.

表1 四种真菌多糖对羟自由基清除能力比较

孙娟等[10]对美味牛肝菌、羊肚菌、松茸及印度块菌四种珍稀食用菌粗多糖对羟自由基清除作用的研究表明，四种珍稀食用菌对羟基自由基均有很好的清除作用，其中美味牛肝菌多糖浓度与清除率二者呈正相关.四种珍稀食用菌粗多糖对羟自由基的最大清除率及所对应的多糖浓度不同（见表1）.

陶明煊等[25]研究表明，金顶侧耳、姬菇和毛头鬼伞三种真菌粗多糖对羟自由基均具有清除作用.三种真菌粗多糖清除率达50%时，所需的浓度分别为2.45、2.60 mg.mL-1和2.59 mg.mL-1.

李芳亮[26]等研究表明香菇多糖（WPLT）和褐蘑菇多糖（WPPA）分级醇沉获取的多糖对·OH均具有清除作用，并呈较好的量效关系，它们都随浓度的增加对·OH的清除率增强.WPLT30、WPLT50、WPLT80、WPPA30、WPPA50和WPPA80在0.05-1mg.mL-1范围内，清除·OH自由基有较好的量效关系.清除·OH的能力从大到小依次是：WPPA80＞WPPA50＞WPLT80＞WPPA30＞WPLT30＞WPLT50.WPPA80、WPPA50和WPLT80的EC50分别为0.32、0.60、0.70 mg.mL-1；

以对羟自由基清除能力为50%时所需的多糖浓度（Ec50）为标准，不同真菌多糖对羟自由基的清除能力比较（见表2）.

表2 真菌多糖对羟自由基清除能力的比较

3.2 不同真菌多糖对超氧阴离子自由基清除能力的比较

盛伟等[23]研究表明，白灵菇、杏鲍菇和阿魏菇对超氧阴离子自由基均具有清除作用，且呈量效关系.在所研究的浓度范围内，三种真菌多糖浓度均在0.25mg.mL-1时表现出最大清除率，分别是52.97%、44.16%、42.56%.证明三种真菌多糖对超氧阴离子自由基的清除能力不同，清除能力按其大小依次为杏鲍菇、白灵菇、阿魏菇.

陶明煊等[25]研究表明，金顶侧耳、姬菇和毛头鬼伞三种真菌粗多糖对超氧阴离子自由基均具有清除作用.三种真菌粗多糖清除率达50%时，所需的浓度分别为0.32、0.36mg. mL-1和0.3mg.mL-1.

李芳亮[26]等研究表明香菇多糖（WPLT）和褐蘑菇多糖（WPPA）对O2-·具有清除作用,不同浓度乙醇醇沉获取的多糖对O2-·清除能力不同.在0.05-1 mg.mL-1的范围内，清除O2-·自由基具有量效关系.它们都随浓度的增加，对O2-·的清除率明显增强.它们对O2-·的清除能力从大到小依次是：WPPA80＞WPPA50＞WPLT80＞WPPA30＞WPLT30＞WPLT50.经计算WPPA80和WPPA50的EC50分别为0.52 mg.mL-1和0.82 mg.mL-1.

几种真菌多糖对超氧阴离子自由基的清除能力比较（见表3）.

表3 真菌多糖对超氧阴离子自由基清除能力的比较

4 小结

综上所述，科学合理的构建产生超氧阴离子自由基和羟自由基的体系，是研究某物质是否对自由基有清除作用的体系保证，清除率的大小是评价某物质对自由基是否有清除作用及清除能力大小的指标.

许多试验研究已证明：真菌多糖对超氧阴离子自由基和羟自由基具有良好的清除作用.在一定的浓度范围内，真菌多糖浓度与多糖对氧自由基的清除率呈良好的量效关系，且随着多糖浓度的增加，清除率升高.不同真菌多糖表现的量效关系所处的浓度范围不同.在良好的量效关系下，以清除率达50%所需的真菌多糖浓度来判断不同真菌多糖对氧自由基的清除能力，发现不同真菌多糖对氧自由基的清除能力不同.清除率达50%时所需的真菌多糖浓度愈低，清除能力相对愈高.目前研究已知，银耳多糖、滑菇多糖、灵芝多糖、金顶侧耳、毛头鬼伞、姬菇六种真菌多糖对羟自由基的清除能力由大到下依次为银耳多糖＞滑菇多糖＞灵芝多糖＞金顶侧耳＞毛头鬼伞＞姬菇.在已研究的六种真菌多糖中对超氧阴离子自由基的清除能力由大到下依次为云芝多糖＞银耳多糖＞毛头鬼伞＞金顶侧耳＞姬菇＞茶薪菇.

5 展望

研究表明，人体内过量的自由基，会引起脂质过氧化、蛋白质变性、DNA链断裂、细胞解体等现象的发生.并证明了人体的衰老，肿瘤、心血管疾病的发生等与体内存在过量的自由基有关.因此寻找有效的抗氧化剂具有重要意义.食用菌作为食品和药用成分在我国已有悠久应用历史，它们不仅有较高营养价值，而且富含多糖.真菌多糖是一类重要的保健功能因子,并且多糖是生物有机体中继蛋白质、核酸之外的第三大生物大分子,多糖具有多种生物活性.真菌多糖的抗氧化活性，这预示着它在医学及人类保健事业上有潜在的利用价值，近些年对食用菌氧自由基和天然抗氧化剂的研究，已成为当今生物医学界研究和开发的热点.食用菌展现出其广阔的应用前景，食用菌天然抗氧化剂必将为人类的健康做出巨大的贡献.

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1673-260X（2013）09-0009-04