咳尔康口服液对哮喘大鼠TNF-α和SOD mRNA表达的影响※

李厚忠张羽飞齐 敏李孟全

咳尔康口服液对哮喘大鼠TNF-α和SOD mRNA表达的影响※

李厚忠1张羽飞1齐 敏2李孟全1

目的观察咳尔康口服液对哮喘模型大鼠TNF-α和SOD活力及其 mRNA表达的影响，阐明咳尔康口服液治疗哮喘的可能机制。方法SD大鼠随机分为四组：正常对照组、模型组、阳性对照组和咳尔康口服液实验组。采用卵蛋白和氢氧化铝制备哮喘模型大鼠，观察咳尔康口服液对大鼠TNF-α和SOD mRNA表达的影响。结果与正常对照比较，模型组大鼠TNF-α mRNA表达明显升高；与模型组相比，咳尔康口服液可以降低TNF-α mRNA表达，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与正常对照比较，模型组大鼠SOD mRNA表达明显降低；与模型组相比，咳尔康口服液可以升高SOD mRNA表达，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论TNF-α和SOD可能参与哮喘的发生，而咳尔康口服液治可以抑制TNF-α mRNA表达水平，同时也可以升高SOD mRNA表达水平，改善哮喘的症状。

咳尔康口服液；哮喘；TNF-α；超氧化物歧化酶

咳尔康口服液是在经典名方“六君子汤”基础之上，经过反复多年实践潜心研究衍化而成。主要成分包括茯苓、陈皮、甘草、紫苑、白术等，具有理气健脾燥湿，化痰止咳之功效。本课题组前期研究结果表明该制剂作用机制可能与降低NO和MDA浓度有关[1]，长期毒性实验也未见明显毒性反应[2]。

细胞因子TNF-α是一种多效应的生物活性分子，也是哮喘发病过程中的一个重要的启动因子，它作为气道强而有力的刺激剂，可以诱导一系列细胞因子的产生。SOD是机体重要的抗氧化酶类，作为氧化——抗氧化研究的经典指标，得到广泛应用。本实验以TNF-α和SOD为研究对象，研究在哮喘模型大鼠血清中TNF-α浓度和SOD活力的变化以及其基因表达情况，评价TNF-α和SOD在哮喘发病过程中的作用，为进一步研究咳尔康口服液治疗哮喘的机制提供参考资料，也为该制剂在临床应用中提供理论基础和实验依据。

1 实验材料

1.1 试药咳尔康口服液制备：处方药材用清水速洗，水煎两次，合并煎液，除尘，浓缩至规定量，分装灭菌既得，黑龙江仁和堂药业有限公司代加工。

1.1.1 动物健康清洁级 SD系大鼠40只，雌雄各半，体重190～210g，购于哈尔滨医科大学动物实验中心，实验动物合格证号为：P00102008，实验动物使用许可证号：SYXK（黑）2008-033。

1.1.2 仪器和试剂恒温水浴箱（天津泰斯鹏仪器有限公司）；微量加样器（德国eppendorf）；自动平衡离心机（北京京立离心机有限公司）；电子天平（日本岛津）；超声雾化器（江苏鱼跃医疗设备股份有限公司）；PCR仪（美国Bio-Rad公司）；NanoDrop2000（美国Thermo Fisher公司）；BioAnalyzer 2100（美国Agilent公司）。RNA 提取液（TRIzol，美国Invitrogen公司）；RT-PCR试剂盒（购自宝生物工程有限公司）；琼脂糖（Agarose）；EB（美国sigma公司）；卵蛋白（OVA，美国Sigma 公司）；泼尼松（天津力生制药股份有限公司）；TNF-α测试盒（美国ADL公司）；SOD测试盒（南京建成生物工程研究所）。其余试剂均为国产分析纯（北京化工厂）。

1.2 方法

1.2.1 给药方法健康清洁级SD大鼠腹腔内注射10%卵蛋白+10%氢氧化铝混合液1ml作为首次致敏，第15天将大鼠依次置于超声雾化器中，用1%卵蛋白生理盐水喷雾激发大鼠哮喘发作，隔日一次，一次20min，共激发28d。以大鼠出现口唇发绀、腹肌痉挛、呼吸加快、点头呼吸或站立不稳等表现表示成功激发。将成功制备的哮喘模型大鼠（40只）随机分为四组（每组10只），分别为咳尔康口服液给药组（Experimental group）、模型组（Model group）、阳性对照组（Positive group）、另设正常对照组（Control group，10只以生理盐水代替卵蛋白进行腹腔注射及雾化吸入给药）。分组后每天灌胃给药，正常对照组和模型组给予等量生理盐水，阳性对照组给予泼尼松10 ml/kg体重，给药组给予咳尔康口服液1.66ml/200g体重，每天1次，连续28d。最后1次给药后2h颈静脉采血2ml，于3000r/min离心机离心10min后取上清液待检测TNF-α浓度和SOD活力。右肺组织取出后，立即置于-80℃冰箱中保存，用于TNF-α与SOD基因mRNA的检测。

1.2.2 肺组织总RNA提取及质量鉴定按照TRIzol试剂说明书的步骤，逐步提取出各组肺组织的总RNA。应用NanoDrop2000测定总RNA 的吸光度A260 值和A280值，用A260 值计算其浓度，并计算A260/A280检测其纯度；使用2100生物分析仪器进一步检测总RNA质量。

1.2.3 RT-PCR肺组织TNF-α和SOD mRNA表达水平检测使用RNA 1μg 以及oligo（dT）引物，使用RT-PCR试剂盒进行反转录反应，合成单链的cDNA。cDNA 产物保存在-20℃。RT-PCR 反应体系：体积为20μL，SYBR Green Taq Ready Mix 10 μL，dNTP正向和反向引物1μL，水7μL 和cDNA 1μL。反应程序为：50℃升温2 min；95℃预变性10 min；95℃变性15 s；60℃退火1 min；扩增40 个循环。每个样本以内参基因Rps16调整。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳后通过凝胶成像分析系统观察并保存图像。引物序列见表1。

表1 RT-PCR 引物序列

1.3 数据统计分析所有实验数据均以均数±标准差（±s）表示，统计学处理均采用t检验法进行显著性检验，P＜0.05为具有统计学意义。

2 结果

2.1 咳尔康口服液对哮喘模型大鼠血清TNF-α浓度和SOD活力的影响

表2 咳尔康口服液对哮喘模型大鼠血清TNF-α浓度和SOD活力的影响(n=10,±s)

表2 咳尔康口服液对哮喘模型大鼠血清TNF-α浓度和SOD活力的影响(n=10,±s)

注：与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与正常对照组比较※P＜0.05

组别 TNF-α(umol/L) SOD(U/mgprot)正常对照组 6.15±1.04 109.64±15.91模型组 9.94±1.72※99.88±16.62※阳性对照组 4.93±1.12**169.17±14.09**给药组 6.57±1.50*115.44±9.43*

咳尔康口服液对TNF-α浓度的影响见表2，模型组的TNF-α浓度与正常对照组比较明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；给药组的TNF-α浓度与模型组比较明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。模型组的SOD活力浓度与正常对照组比较明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；给药组的SOD活力与模型组比较明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 总RNA 的质量检测用Trizol溶液分别提取肺组织总RNA，操作按试剂盒进行。NanoDrop2000测定总RNA浓度（260nm），A260/280值在1.8～2.1之间，A260/230大于1.8，说明很酸纯度较高（比值未列出）。使用2100生物分析测定总RNA完整性，完整性RIN均为10，表明RNA无降解，质量可靠（图1）。上述实验结果表明，各样本RNA 均有较好的质量，完全可以满足后续的RT-PCR 的实验要求。

图1 部分样品RNA完整性检测

2.3 咳尔康口服液对哮喘模型大鼠支气管平滑肌TNF-α和SOD mRNA的表达情况图2结果显示，哮喘模型大鼠SOD mRNA的表达较对照组降低，TNF-α mRNA的表达较正常对照组增高。哮喘给药处理后，大鼠SOD mRNA的表达有所升高，TNF-α mRNA的表达有所降低，与阳性对照组表达一致。

图2 PCR结果

3 讨论

支气管哮喘是临床上常见的慢性多发疾病，具有反复发作、迁延难愈的特点。在哮喘的发病过程中，有多种炎症基因表达增加或多种炎症基因异常表达的炎症反应。TNF-α是由单核巨噬细胞所产生的一种多肽细胞炎性介质，与机体的炎症、免疫反应有着十分密切的关系，在哮喘的发病过程中起重要作用。正常人血清TNF-α的浓度很低，适量的TNF-α对机体的保护反应是必需的，但当TNF-α受到过敏原等刺激后可大量释放，加重气道炎症以及引起哮喘发作[3]。哮喘发作期患者TNF-α浓度明显高于缓解期及正常对照组，而且哮喘病情越严重，持续时间越长，其血清TNF-α浓度越高[4]，这与本实验的研究结果恰恰相符。本实验中，采用ELISA法测定了哮喘模型大鼠血清TNF-α浓度，结果发现哮喘模型大鼠血清TNF-α浓度均较正常对照组明显增高，由此可以认为TNF-α参与了哮喘的发生。而后进一步应用RT-PCR法测定了哮喘模型大鼠肺组织TNF-α mRNA的表达。结果表明，哮喘模型大鼠TNF-α mRNA的表达较正常对照组增高，说明哮喘模型大鼠TNF-α浓度升高可能系由肺组织TNF-α mRNA表达增加，TNF-α生成增多，释放入血所致。由此可见，TNF-α与哮喘有着密切关系，参与哮喘的病理生理过程。给药组给予咳尔康口服液干预治疗后，哮喘模型大鼠血清TNF-α浓度明显降低，同时肺组织TNF-α mRNA表达也相应降低，由此可以认为，咳尔康口服液可能是通过降低哮喘模型大鼠肺组织TNF-α mRNA表达进而降低血清中TNF-α浓度来发挥缓解哮喘的发作。

超氧化物歧化酶（SOD）是体内重要的抗氧化酶，其活性可衡量体内抗氧化系统防御自由基损伤的能力[5]。研究表明哮喘发作过程中可产生大量氧自由基。氧自由基能显著增强细胞膜的脂质过氧化作用，消耗大量SOD损害气道壁上皮细胞，促进气道高反应性和气道重塑形成而引起哮喘[6]。本实验研究表明，哮喘模型大鼠模型组SOD活力明显低于正常对照组（P＜0.05），而肺组织SOD mRNA的表达亦低于正常对照组，这表明SOD可能参与哮喘的发生。咳尔康口服液可增加SOD mRNA的表达进而升高血清SOD活力，增强机体的抗氧化能力。

[1]李厚忠,林峰,金秀东.咳尔康口服液对哮喘大鼠几种生化指标的影响[J].毒理学杂志,2011,25(1)：46-48.

[2]李厚忠,孙展鹏,王元奕.咳尔康口服液长期毒性实验[J].毒理学杂志,2009,23(6)：508-509.

[3]Shakoory B,Fitzgerald SM,Lee SA,et al.The role of humanmast cell-derived cytokines in eosinophil biology[J].J Interferon Cytokine Res,2004,24(5)：271.

[4]Silvestri M,Bontempelli M,Giacomelli M,et al.High serum levels of tumour necrosis factor-alpha and interleukin-8 in severe asthma：markers of systemic inflammation[J].Clin Exp Allergy, 2006,36(11)：1373.

[5]张伊伟,叶发民,魏文启.支气管哮喘患者外周血IL-4、TNF-α测定及临床意义[J].临床医学,2005,25(4)：82.

[6]邱晨,史菲.肺表面活性物质对哮喘大鼠血清一氧化氮、丙二醛含量及超氧化物歧化酶活性的影响[J].中国呼吸与危重监护杂志,2004,3(5)：312-313.

Keerkang Oral Liquid on the Expression of TNFαand SOD mRNA in Asthmatic Rats

Li Houzhong Zhang Yufei Qi Min Li Mengquan

ObjectiveTo evaluate the effect of Keerkang Oral Liquid on activities of TNF-α and SOD and the expression of TNF-α and SOD mRNA in asthmatic rats.MethodsThe asthmatic models were established by injecting ovalbumin (OVA) into abdomen and atomization, then treated with Keerkang Oral Liquid.The serum was collected for detecting the levels of TNF-α and SOD .Lung tissues were ground into homogenate and the expression of TNF-α and SOD mRNA was assayed using RT-PCR.ResultsCompared to control group, the levels of TNF-α mRNA were significantly higher, but the expression of SOD mRNA decreased in asthmatic group.After Kerkang oral liquid treatment, the levels of TNF-α mRNA were significantly lower, and the expression of SOD mRNA increased in therapeutic group compared to the asthmatic group.ConclusionKeerkang Oral Liquid could decrease the expression of TNF-α mRNA and increase the expression of SOD mRNA.So it might have certain preventive and therap- SODeutic effect on Asthma.

Keerkang Oral Liquid; Asthma; TNF-α; Superoxide dismutase

R99

A

1673-5846(2013)08-0193-03

1牡丹江医学院药学院，黑龙江牡丹江 157011

2牡丹江医院附属二院，黑龙江牡丹江 157011

黑龙江省卫生厅科研课题（编号：2010-233）；黑龙江省中医药管理局（编号：ZHY10-W73）

李厚忠（1979-），男，黑龙江省哈尔滨市呼兰区人，硕士，主要从事药理学和毒理学研究。

李孟全（1962-），女，博士，教授，主要从事心血管药理学研究工作。Email：lmq6204@126.com。