超声法提取山楂果实中总黄酮的工艺研究※

马燕斌 李瑞明 刘 怡 张俊鹏 林银奎 梁耀荣

超声法提取山楂果实中总黄酮的工艺研究※

马燕斌 李瑞明 刘 怡 张俊鹏 林银奎 梁耀荣

目的建立超声法提取山楂果实总黄酮的最佳提取工艺。方法以总黄酮收率为指标，正交设计法优化山楂总黄酮的提取工艺。结果最佳超声提取工艺：乙醇浓度为70%，料液比为1：20，超声提取时间为40min，提取率3.85%。结论该方法可用于山楂总黄酮的提取，提取方法简单易行、提取时间短、效率高。

山楂；总黄酮；正交设计法

山楂为蔷薇科山楂属植物山里红Crataegus p.innatifida Bge.var.major N.E.Br.或山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥成熟果实，是一种重要的药食两用资源[1-2]。山楂是我国特有的药果兼用树种，中药山楂在我国的应用历史悠久，李时珍的《本草纲目》记载：此品“酸甘味温，消食积，补脾”。山楂具有较多的功能，即消食健胃、行气散瘀；可用于肉食积滞、泻痢腹痛、瘀血经闭、心腹刺痛、高血脂症等[3]。山楂的化学成分包括三萜类、黄酮类、原花青素、有机酸等[4]。山楂具有较好的药理活性，如强心[5]、降血脂[6-7]和抗氧化[8]。芦丁、儿茶素、原花青素等黄酮类成分为山楂中的主要活性成分。临床研究表明，山楂的醇提物可以增加充血性心脏衰竭患者的运动耐量[5]，还可以诱导AMPK的磷酸化，降低葡萄糖和甘油三酯的生成，降低血糖、甘油三酯和胆固醇[9]。山楂的无糖水提物的主要成分为绿原酸、原花青素B2、（-）-儿茶素、芦丁和异槲皮素，它可能通过改善脂质代谢，减少炎症细胞因子，保护内皮细胞来降低甘油三酯和胆固醇，抑制动脉粥样硬化[10]。本研究针对如何利用超声法提取山楂果实中总黄酮进行研究，为山楂中黄酮类成分的进一步研究奠定基础。

1 仪器与试剂

1.1 主要仪器SB25-12D台式超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；UV/VIS 916紫外-可见分光光度计（岛津公司）；SHZ-D循环水式真空泵（巩义予华仪器有限公司）；电子分析天平（Sartorius公司）。

1.2 试剂与材料芦丁标准品（批号100080-200707）；95%乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均购自广州化学试剂厂；山楂果实（产地为山东枣庄）。

2 方法与结果

2.1 正交实验设计通过预实验，采用乙醇作为溶媒可将山楂中黄酮类成分提取得到。乙醇提取山楂总黄酮的提取工艺与乙醇浓度、料液比和提取时间等因素有关，因此采用三因素三水平L9（34）进行正交实验设计，其因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表

2.2 山楂总黄酮的提取及检识先将山楂粉碎后过10目筛，精密称取山楂粉末5.0g，按照正交设计结果进行超声提取，提取3次。提取完成后合并提取液，抽滤，并用少量相应浓度的乙醇洗涤滤渣。将滤液转移至量筒中，加入适量体积的乙醇，使其体积与反应前保持一致，4℃保存，备用。

黄酮类成分的检识：①（Molish反应）精密吸取上述滤液各1.00mL，置于小试管中，加乙醇0.5mL，加α-萘酚数mg，斜置试管，沿管壁加入浓硫酸约0.50mL，静置，观察二层溶液界面的变化，有紫红色环出现。②（盐酸-镁粉反应）用移液管吸取上述滤液各1.00mL，置于小试管中，加镁粉25mg，滴加浓硫酸，溶液由黄变红。以上反应证明溶液中可能含有芦丁等黄酮类物质。

2.3 对照品溶液的制备精密称取在120℃干燥至恒重的芦丁对照品12.50mg，置25mL量瓶中，加适量无水乙醇溶解，加无水乙醇至刻度，摇匀，配制成每1mL中含无水芦丁0.50mg的溶液。

2.4 标准曲线的制备精密量取对照品溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL，分别置25mL量瓶中，各加水至6mL，加5%亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6min，加10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min，加氢氧化钠试液10mL，再加水至刻度，摇匀，放置15min，以相应试剂为空白，立即按照紫外-可见分光光度法，在500nm的波长处测定吸光度。以芦丁浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得芦丁的线性回归方程为A=19.716C－0.043，r=0.9993，表明芦丁的质量浓度在20～120μg/mL范围内与吸光度值线性关系良好。

2.5 样品的测定精密量取0.20mL“2.2项”下提取所得山楂总黄酮提取液置于25mL容量瓶中，各加水至6mL，以下同“2.4项”操作，在500nm的波长处测定吸光度。含总黄酮以无水芦丁（C27H30O16）计，结果如表2、3所示。

表2 山楂总黄酮含量测定结果(n=3,%)

表3 方差分析表

由表2和表3可知，三种因素对提取效果影响大小依次为：B料液比＞A乙醇浓度＞C超声提取时间。其中料液比影响最大，其次是乙醇浓度。由表可确定最佳提取工艺条件为A2B3C3，即超声提取最优条件为：乙醇浓度70%，料液比1：20，提取时间40min。

2.6 最佳提取工艺的验证为进一步考察上述最佳工艺的稳定性和合理性，按该工艺条件进行重复性实验3次，分别测定山楂总黄酮的含量，结果见表4。

表4 提取工艺的验证结果(mg,%)

测定的结果均等于或优于正交实验表中的任何一组，重现性好，说明该工艺稳定可行。

2.7 统计学处理本实验中相关数据的处理使用EXCEL和统计学软件SPSS 19.0。

3 讨论

黄酮类化合物在其基本碳架上含有碱性氧原子，而绝大多数都是带有酚性羟基的衍生物，因而能与某些金属离子产生络合反应和某些较强的还原剂发生颜色反应。故可采用紫外-可见分光光度法测定提取液中总黄酮。因此选择以芦丁为标准品，硝酸铝为显色剂，测定山楂中总黄酮含量。通过提取工艺的验证实验结果可以看出，最佳工艺的结果大于正交实验表中的任何一组，重现性好，说明该工艺稳定可行。超声波提取方法具有操作简单、作用时间短、提取效率高、提取物纯度高、无需加热、剩余物无有害残留、可以综合利用等优点。此外，采用乙醇超声提取方法简便易行，节约有机溶剂，所用试剂对人体较为安全。因此适于大规模生产，剩余物为糖果胶蛋白质和纤维素等，可以作为食品原料加以综合利用。

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Study on Extraction Process of Total Flavonoids from Fruits ofCrataegus pinnatifida Bge.by Uultrasonic Extraction Method

Ma Yanbin Li Ruiming Liu Yi Zhang Junpeng Lin Yinkui Liang Yaorong

ObjectiveTo establish the extraction process of total flavonoids from fruits ofCrataegus pinnatifida Bge.by ultrasonic method.MethodsOrthogonal design was used to optimize the extraction process of total flavonoids from fruits ofCrataegus pinnatifida Bge.with asset recovery ratio of total flavonoids index tried to evaluate.ResultsThe optimum extraction conditions were confirmed as follows:concentration of ethanol was 70%,extraction time was 40 min,ratio of to solid liquid was 1:20,The extraction rate of flavonoids under this condition was 3.85%.The experimental values agreed with the predicted values.ConclusionThe extraction method of total flavonoids was simple, reasonable and efficiency with short time.

Crataegus pinnatifida Bge.; Total flavonoids; Orthogonal design

R284.2

A

1673-5846(2013)08-0030-03

中山大学附属第一医院药学部，广东广州 510080

广东省重大科技专项项目（2011A080300004）；广东省中医药局科研项目（20121145）；广州市生物产业示范工程发展专项项目（2012-243）

马燕斌（1977.6-），女，本科，主管药师，主要研究中药和医院药学。E-mail：179621079@qq.com。

李瑞明（1974.7-），男，本科，主管药师，主要研究方向为医院制剂。E-mail：liruiming321@163.com。