相似穿孔线虫拮抗细菌的筛选及分子鉴定

朱莲英，吴凤芝，赵志祥，王会芳，陈绵才*海南省农业科学院农业环境与植物保护研究所，海南省植物病虫害防控重点实验室，海南海口5700;海南大学环境与植物保护学院，海南海口5708

植物寄生线虫是一类重要的病原物，分布广，种类多，全世界已报道的植物寄生线虫有200多个属5000余种，给农林业生产造成严重危害(冯志新，2001)。现阶段植物寄生线虫病的防治多采用化学药剂、轮作和抗病品种，对于香蕉这种多代生长的植物来说，轮作可行性较小。目前使用的化学杀线剂一般属高毒、高残留农药，不但给微生物、植物、水源和大气层带来严重污染和破坏，而且会直接对人体造成危害。近年来，随着国家大力倡导农业生产的可持续发展，线虫生物防治越来越受到重视，特别是利用细菌、真菌的代谢产物控制线虫病害已取得显著成果(刘丹丹，2007;牛秋红等，2010)。由于根际细菌是从植物根际分离所得，具有与根亲和力强、拮抗性强、易于培养应用等特点，利用根际细菌防治寄生线虫已成为国内外研究热点之一(郭荣君等，1996)。目前，已有坚强芽孢杆菌Bacillus firmus、巨大芽孢杆菌B.megaterium、短小杆菌Curtobacterium luteum、荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens和恶臭假单胞菌P.putida对相似穿孔线虫Radopholus similis(Cobb)Thorne具有拮抗活性的报道(Aaltenet al.，1998;Aravindet al.，2010;Mendozaet al.，2008)。笔者运用等比稀释涂布平板法试图从染病香蕉植株根际土壤分离菌株，通过室内生物测定和盆栽试验，筛选获得对相似穿孔线虫具有毒杀活性的菌株，以期为相似穿孔线虫病的生物防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

土样采集:采用十点取样法从5～15 cm土层采集感染相似穿孔线虫的香蕉根际土壤，共采集39份土样。土样自然风干后过200目筛，封装于密封袋中并编号，置于4℃冰箱保存备用。

供试线虫:相似穿孔线虫由海南省农业科学院农业环境与植物保护研究所植物病理实验室保存于胡萝卜愈伤组织上。

供试植物:香蕉Musa paradisiacaL.。

1.2 拮抗菌株的分离和保存

采用等比稀释分离法分离拮抗菌株。每个土样称取5 g粉末置于无菌三角瓶中，加入100 mL无菌水，于160 r·min－1振荡 30 min，按 10 倍稀释法依次稀释至 10－2、10－3、10－4、10－5、10－6。各吸取 200 μL稀释液涂布于KB培养基平板上，用封口膜封好，培养皿放于28℃生化培养箱中倒置培养48 h。每个土样和稀释梯度均重复3次。

挑取单菌落于装有1 mL液体培养基的2 mL无菌离心管中，在160 r·min－1、28 ℃下摇床振荡12 h。然后用无菌移液枪吸取200 μL菌液与60 μL 50%甘油混合于96孔板中，－20℃冰箱保存备用。

1.3 相似穿孔线虫的培养

将分离获得的相似穿孔线虫进行纯化培养。从中挑选活力较强的相似穿孔线虫25条置于盛有1 mL无菌水的2 mL无菌试管中，加入0.5 mL 0.5%硫酸链霉素，3～6 h后，用无菌移液枪吸去上层液，加入1 mL无菌水，轻轻震荡。然后以4℃、3500 r·min－1离心 3 min，弃上清液，再加无菌水，离心，重复2～3次。超净工作台上用灭菌移液枪将无菌线虫悬浮液吸到胡萝卜愈伤组织上，置于25℃生化培养箱中黑暗培养40～60 d，获大量纯化的相似穿孔线虫备用(陈淳等，2006)。

1.4 分离菌株的培养与上清液的制备

采用摇瓶发酵法，从－20℃冰箱中取出96孔板，分别吸1 μL菌液于装有20 mL NA液体培养基的三角瓶中，于28℃下160 r·min－1摇床振荡培养72 h。分离菌株的培养物于 4℃、6000 r·min－1离心2 min，取上清液备用。

1.5 相似穿孔线虫拮抗菌株的筛选

分离的细菌菌株对相似穿孔线虫的活性测定在24孔平底细胞培养板中进行。每孔加入1 mL分离菌株的上清液和相似穿孔线虫约300条·孔－1，以无菌水处理为对照，每个处理重复3次。处理4、8、12、24和48 h后分别观察和计数。基于供试线虫的假死现象，在体视显微镜下用自制毛笔刺激线虫，僵直不动视为死亡，呈弯曲蠕虫状为活虫。

生测结果计算参照陈立杰等(2008)的方法:线虫死亡率(%)=死亡线虫数/供试线虫数×100。

数据处理采用EXCEL 2003软件，统计分析采用DPS v7.05软件，用Duncan's新复极差法在5%显著水平上进行多重比较。

1.6 盆栽试验

采用发酵液浸根和灌根法测定拮抗菌株发酵液对相似穿孔线虫的活性。将获得的拮抗菌株菌剂浓度调至 109cfu·mL－1，以 1.8%阿维菌素乳油1500倍液作阳性对照，以无菌水作阴性对照。用供试菌株的培养液浸泡香蕉根部10 min，移栽入塑料钵中，每钵1株香蕉苗，重复3次;再用相应生防菌剂灌根处理，每株3 mL。48 h后接相似穿孔线虫，每盆接种线虫1500条，7 d后用相应菌剂灌根处理，每株3 mL。接种42和70 d后，将植株整盆倒出，测量香蕉株高、根质量和茎围，计数根部相似穿孔线虫数量，并对结果进行统计分析，方法同1.5。

生防效果测定参照Chaveset al.(2009)的方法:BC(%)=100×［1－(NT/NC)］。

式中:NT指拮抗菌处理存活的线虫数量，NC指空白对照存活的线虫数量。

1.7 拮抗菌株的分子鉴定

1.7.1 细菌菌液的制备 从划线培养的平板上挑取单菌落接种到100 mL LB液体培养基中，于37 ℃、200 r·min－1振荡培养12 h，活化菌株备用。

1.7.2 16S rDNA的PCR扩增和序列分析 细菌基因组的提取及16S rDNA的扩增参照牛秋红等(2005)的方法，采用细菌通用引物 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492 R(5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')进行扩增(赵志祥等，2010)。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，并按照百泰克胶回收试剂盒的说明，回收约1.5 kb的DNA片段。

1.7.3 测序及序列分析 将上述回收的DNA片段连接到克隆载体pMD18T(TaKaRa)上，筛选阳性克隆载体并送至上海生工生物技术有限公司进行测序。将拼接好的序列在Blast软件的Genbank数据库中搜索相似性，选取同源性最高的典型菌株进行序列比对分析及构建系统进化树，从而对菌株进行鉴定。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌株上清液对相似穿孔线虫幼虫的活性

对分离到的789株细菌菌株进行杀线虫活性初步筛选，结果发现，96株供试菌株的发酵上清液对相似穿孔线虫幼虫的致死率均达到80%以上。其中，5 株细菌(编号 HD-34、HD-46、HD-54、HD-86、HD-93)菌株发酵上清液在24 h内对相似穿孔线虫幼虫的致死率达90%以上，在48 h内致死率达100%(表 1、图1)。

表1 拮抗菌株上清液对相似穿孔线虫的活性Table 1 Activity of antagonistic strains supernatants on R.similis

图1 5个菌株发酵上清液24 h对相似穿孔线虫的拮抗作用Fig.1 Effect of five antagonistic bacterial supernatant on R.similis，24 hours after inoculation

2.2 拮抗菌株发酵液对香蕉相似穿孔线虫的防控效果

结果表明，接种5株拮抗细菌42 d后，各处理的香蕉根部存活线虫数量均大幅度减少，其中以HD-86表现最好，相对防治效果达77.34%，与阿维菌素的防效相当(表2)。接种70 d后，HD-86和HD-54处理的香蕉根部存活的线虫数量持续下降，相对防效分别达90.51%和90.18%，而阿维菌素的防效仅为63.97%;此时，与空白对照相比，5株拮抗细菌处理的香蕉植株株高、茎直径和根质量均明显增大，差异均达显著水平(表3)。从结果还可以看出，5个拮抗细菌菌株在接种后42～70 d对相似穿孔线虫的防治效果均呈上升态势，而阿维菌素的防治效果却明显下降，表明这些拮抗菌株对相似穿孔线虫的防控具有较长的持效期。

2.3 拮抗菌株16S rDNA的PCR扩增和序列分析

2.3.1 PCR产物电泳及回收转化 以提取和纯化的拮抗细菌基因组 DNA为模板，经PCR扩增，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测并回收，获得约1500 bp的DNA片段(图2)。

2.3.2 序列分析 经上海生工生物技术有限公司测序，从菌株 HD-34、HD-46、HD-54、HD-86 和 HD-93中扩增所获得的基因片段分别为1665、1516、1509、1509和1516 bp，其与Genbank数据库中属的相似性见表4。

表2 室内盆栽香蕉接种拮抗细菌42 d后对相似穿孔线虫的作用效果Table 2 Control effect of five antagonistic bacteria on R.similis in potting banana trial in greenhouse，42 days after inoculation

表3 室内盆栽香蕉接种拮抗细菌70 d后对相似穿孔线虫的作用效果Table 3 Control effect of five antagonistic bacteria on R.similis in potting banana trial in greenhouse，70 days after inoculation

图2 拮抗菌株16S rDNA基因扩增产物Fig.2 PCR amplification of antagonistic bacteria 16S rDNA gene by bacterial universal primers

表4 5株拮抗细菌菌株与属的相似性Table 4 The similis of five antagonistic bacteria with genus

将测定的拮抗菌株HD-86的基因序列结果登录Genbank进行Blast检索，并与已报道的16S rDNA序列进行比对，构建系统发育树(图3)，发现该菌株的序列与Burkholderia cepaciaisolate MSMB10单独构成一个分支，由此将其鉴定为洋葱伯克氏菌Burkholderia cepacia。

图3 菌株HD-86的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strain HD-86

3 讨论

细菌的繁殖速度快，易于培养，所需要的养分简单，成本低，因而利用细菌开发环保生物农药防治植物线虫病害，越来越具有研究和应用价值。然而，目前我国对细菌的杀线虫活性机理方面的研究起步较晚，需要筛选出大量的具有杀线虫活性的细菌资源为其提供研究基础(牛秋红等，2005)。本研究从香蕉根际土壤获得了5株对相似穿孔线虫具有拮抗活性的细菌菌株，一定程度上丰富了杀线虫微生物的利用资源。

前人研究证实，植物线虫拮抗细菌有芽孢杆菌和荧光假单胞杆菌等(Aaltenet al.，1998;Aravindet al.，2010)。本文从染病香蕉植株根际土壤分离物中筛选到1株编号为HD-86的对相似穿孔线虫具有极高拮抗活性的细菌菌株，并将其鉴定为伯克霍尔德菌属下的洋葱伯克氏菌。据报道，伯克霍尔德菌属细菌能抑制植物病原真菌，具有生物防治和促进植物生长的功能(陈京元等，2011;权春善等，2005)。本研究的生物测定和盆栽试验结果表明，菌株HD-86不仅能有效地控制相似穿孔线虫的种群数量，而且持效期长，同时明显促进香蕉植株生长。这可能与香蕉根部接种HD-86后，细菌在植株根部区域大量增殖，或者产生某些混合物质共同抑制相似穿孔线虫的生长与繁殖有关，也可能是其诱导植物抗性，从而减轻了线虫对香蕉植株的侵染(Perry＆Moens，2012)。尽管如此，洋葱伯克氏菌对相似穿孔线虫的作用方式和作用机理，以及其能否开发成菌剂进行商品化生产，均有待进一步探索和研究。

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