MRC-5、Vero、Hep-2及 RD 细胞对柯萨奇A16病毒的敏感性比较

杨海玉，查 杰，马智龙

(泰州市疾病预防控制中心，江苏泰州225300)

手足口病是5岁以下儿童中发生的常见传染病，但目前尚无针对手足口病的预防性疫苗或治疗性药物。柯萨奇A16(CoxA16)病毒是引起儿童手足口病的重要病原体，其地方株的分离是对本病进行诊断和防治的基础，可以为我国对CoxA16的研究、毒株的鉴定提供参考和依据［1］。细胞培养是分离病毒的传统可靠方法，50%组织培养感染剂量法(TCID50法)指能在半数细胞培养板孔或试管内引起细胞病变(CPE)的病毒量，已被用于测定许多种病毒的滴度，与其他传统方法相比，具有速度较快、结果可重复、更稳定的优点，且能间接反映病毒的感染力。2012年9～12月，本研究通过观察MRC-5、Vero、Hep-2及RD细胞在相同条件下感染CoxA16后的TCID50，比较其对CoxA16的敏感性。现报告如下。

1 材料与方法

1．1 材料 Vero、MRC-5细胞由中科院上海细胞库提供，RD、Hep-2细胞由江苏省疾控中心流感室提供，均由本实验室稳定传代后保存。CoxA16病毒为泰州市2012年手足口病监测临床样本中分离，由Vero细胞传代扩增。随机选择3株用于实验，编号为 TZCoxA16-001、TZCoxA16-002、TZCoxA16-003。DMEM培养液、胎牛血清、青霉素链霉素双抗和EDTA-胰酶等为 Gibco产品，其他试剂均为国产分析纯。

1．2 方法

1．2．1 细胞传代培养 MRC-5、Vero、Hep-2及 RD细胞分别培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养液中，37℃、5%CO2、饱和湿度传代，分数个T25细胞瓶。待细胞长成单片80%以上时，换培养液1次，总体积为6 mL。

1．2．2 敏感性检测 上述4种细胞经消化液消化后，800 r/min离心3 min，加10 mL培养液重新悬浮，吹打均匀，用排枪吸100μL加入96孔培养板，每加1次，剩下的细胞液要重新吹打均匀。细胞加完后，上下左右混合均匀，置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养12 h。弃去培养液，用D-hanks液清洗2遍。将3株CoxA16病毒毒株用病毒生长液分别作 10 倍系列稀释，取 10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7、10－8共 8 个稀释度，每个稀释度取0．1 mL 分别接种于长满单层的 MRC-5、Vero、Hep-2及RD细胞的96孔细胞培养板中，每个稀释度接种10孔，另设16孔只接种稀释液作为空白对照，0．1 mL/孔。置于37℃、5%CO2培养箱中培养120 h，每12 h观察各孔CPE情况，出现CPE为感染，即细胞圆缩、折光性增强、细胞核固缩、碎片增多，胞体逐渐空泡化直至破裂。见插页Ⅲ图4。及时记录细胞病变孔数，直到对照细胞老化脱落为止，取3株毒株培养板的平均值。“+”表示25%以内细胞出现CPE;“++”表示25% ～50%细胞出现CPE;“+++”表示50% ～75%细胞出现 CPE;“－”表示无CPE;“/”表示培养终止。按 Reed-Muench 法［2，3］计算各细胞培养96、108、120 h的TCID50。

2 结果

2．1 4种细胞接种后CoxA16病毒CPE情况 见表1。

表1 4种细胞接种CoxA16病毒后CPE情况

2．2 4种细胞不同培养时间的TCID50 见表2。

表2 4种细胞不同培养时间的TCID50

3 讨论

自2008年以来，我国儿童中手足口病流行趋势越来越严重。仅2010年国家卫生统计数据显示，我国内地共发生1 774 669例手足口病病例，造成905例死亡和超过2万例重症。CoxA16和人肠道病毒71型(EV71)是引起手足口病的主要病原体［4］。CoxA16病毒属于小核糖核酸(RNA)病毒科，肠道病毒属，可致人类多种疾病。自1948年从脊髓灰质炎患儿粪便中分离出该病毒以来，已在全世界引起多次爆发和流行，受到人们的广泛关注［5，6］。在CoxA16流行期间，虽然可通过血清中和试验和核酸扩增测序等手段进行鉴定分型，但病毒分离培养仍然是十分实用和可靠的诊断办法［7］。

分离肠道病毒所选用的细胞系一般都为人源或猴源细胞［8］，本研究根据以往实验经验结合本实验室细胞库储存，选择了MRC-5、Vero、Hep-2及RD 4种细胞，通过几种细胞可引起CPE的出现时间及TCID50值来综合比较其对CoxA16的敏感性。结果显示，Vero和RD细胞在36 h即可出现肉眼可见的细胞病变，Vero和RD细胞96 h的TCID50分别是5．45、2．61。这提示 Vero细胞敏感性最好，病毒产量也最高，在感染后4～5 d可收获;而RD细胞出现细胞病变最快，一般在2～3 d，但病毒滴度不高。这和手足口病预防控制指南(2009版)中描述的RD细胞培养CoxA16病毒需要盲传一代［9］的说法一致，也可能和本实验室存储的RD细胞代次较低，敏感性下降有关。Hep-2细胞也能形成稳定的细胞病变，可作为CoxA16分离培养的可选细胞;MRC-5由于在体外传代数有限，且培养周期较长，故在实验室应用受到一定限制［10］。

本研究证明，4种细胞对CoxA16病毒的敏感性由高到低依次为 Vero、RD、Hep-2、MRC-5。因此，Vero细胞可作为当前本地区CoxA16病毒分离的首选细胞，为进一步研究提供了技术储备，但本研究是用CoxA16病毒毒株稀释后模拟样品进行实验，进一步的结论还需要大量不同时期样品的验证。

［1］李兰娟．手足口病［M］．杭州:浙江科学技术出版社，2009:1-61．

［2］中华人民共和国农业部．中华人民共和国兽用生物制品质量标准(2001年版)［S］．北京:中国农业科技出版社，2001:303．

［3］Gustafsson RK，Engdahl EE，Fogdell-Hahn A．Development and validation of a Q-PCR based TCID50 method for human herpesvirus 6［J］．Virol J，2012，18(9):311．

［4］杨海玉，马智龙，查杰．泰州市2009年手足口病病原检测分析［J］．中国热带医学，2010，10(1):65-111．

［5］王潇潇，郝春生，李懿，等．33株柯萨奇病毒A组16型分离株的全基因序列分析［J］．中国生物制品学杂志，2013，26(3):309-314．

［6］武珊，王文瑞，海岩．柯萨奇病毒A组16型研究进展［J］．疾病监测与控制杂志，2011，5(8):478-480．

［7］杨海玉．MDCK、Vero和Hep-2细胞共培养分离甲型H1N1型流感病毒［J］．医学动物防制，2011(5):438-439．

［8］David MK，Peter MH．Fields Virology［M］．5th ed．Philadelphia USA:Lippincott Williams and Wilkins，2007:845．

［9］卫生部．手足口病预防控制指南(2009版)［R］．卫生部公报，2009，12:64．

［10］易波，顾文珍，贺天峰，等．宁波市2010年-2011年重症手足口病病原学及流行特征分析［J］．中国卫生检验杂志，2012，22(7):1670-1673．