蓝莓不可萃取多酚的酸法提取工艺优化

韩彩静, 谢春阳, 陈相艳, 王文亮, 程安玮,*, 弓志青, 石贤权

(1.山东省农业科学院农产品研究所,山东济南 250100;2.吉林农业大学食品科学与工程学院,吉林长春 130118)

蓝莓(Vaccinium corymbosum L.)属于杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium)植物.营养丰富,被称为“水果皇后”.蓝莓果实中除了常规的糖、酸和Vc外,还富含 VE、VA、VB、SOD、熊果苷、蛋白质、花青苷、食用纤维以及丰富的 K、Fe、Zn、Ca等元素.蓝莓亦含有大量有利于视网膜的花青素,因此蓝莓又被称为“美瞳之果”.

多酚类化合物是指分子结构中有若干个酚性羟基的植物成分的总称,包括黄酮类、单宁类、酚酸类以及花色苷类等.根据多酚结合方式和萃取方法的不同,将其分为可萃取多酚(extractable polyphenols,EPP)和不可萃取多酚(non-extractable polyphenols,NEPP).可萃取多酚主要是指通过简单的有机溶剂萃取或水就可以获得的处于游离状态的多酚,而不可萃取多酚主要是指结合于细胞壁上的一些水合单宁酸和原花青素,需通过化学或者酶处理方法,打破多酚物质与细胞壁结合的化学键,才将其分离出来的部分[1].总多酚(total polyphenols,TPP)是指EPP和NEPP的加和[2].虽然有关NEPP早在1973年就有研究,但由于缺乏合适的分析研究方法,一直没有引起人们的注意[3].最近Arranz等[1]研究指出,NEPP需要用酸加热,将其从细胞壁分离,然后再萃取.Matthews等[4]也指出可以从残渣中用硫酸水解的方法,分离制备不可萃取原花青素.Madhujith等[5]采用碱水解的方法研究了大麦中的EPP和NEPP.但这些研究者仅简单指出用酸或者碱水解的方式,对具体的提取分离参数没有相关的研究.此外,近来有关多酚提取纯化及抗氧化活性研究的文献很多,但基本上是集中在可萃取部分[6-10].

本实验以蓝莓为原料,首先除去可萃取部分,然后采用酸水解的方法,对萃取溶剂种类、萃取溶剂浓度、萃取温度、时间、料液比等参数进行了研究,并进一步采用响应面法对各个参数进行优化,确定最佳酸法提取工艺.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜速冻蓝莓,从济南市场购买,进口商品,品牌为Midgold.室温解冻后用打浆机打浆.2 mol/L福林酚试剂和标准品没食子酸(gallic acid),色谱纯,美国 Sigma公司;乙醇、浓 H2SO4、甲醇、Na2CO3均为分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司.

1.2 实验仪器

组织匀浆机,飞利浦公司;超声波清洗机,宁波新芝生物科技股份有限公司;高速万能粉粹机,北京市永光明医疗仪器厂;UV160型紫外分光光度计,日本岛津;水浴锅,上海精宏实验设备有限公司;电热恒温干燥箱,上海精宏实验设备有限公司;电子天平,奥豪斯仪器(上海)有限公司;离心机,上海安亭科学仪器厂.

1.3 实验方法

1.3.1 多酚萃取率的测定

采用福林-酚法测定多酚含量[11].取100 μL萃取液,加2 mL蒸馏水和200 μL福林-酚试剂混匀,然后加900 μL 20%质量浓度的Na2CO3,混匀,在暗处存放2 h,测定765 nm处吸光度值.以没食子酸为标准物,绘制标准曲线y=0.003x+0.029,R2=0.999 2,其中y表示吸光度;x表示多酚浓度,单位μg/mL.

1.3.2 去除可萃取多酚

将新鲜蓝莓果打碎成浆,按料液比(质量浓度,g/mL)1∶2.5加入体积分数为50%的乙醇萃取液,常温下200 W超声提取1 h,取出后4 000 r/min离心15 min,分离上清液和沉淀.在沉淀中重新加入50%乙醇,重复一次,留滤渣备用.将滤渣50℃烘干,粉粹机打成细粉.细粉即为去除EPP蓝莓粉,作为实验材料.

1.3.3 NEPP提取的单因素实验

实验时,取0.2 g物料,按照实验设计的条件,进行操作萃取,对萃取液稀释10倍后,测定吸光度,结果根据1.3.1标准曲线计算出NEPP质量浓度(μg/mL),然后按照稀释倍数、萃取液体积与被萃取的物料质量,计算出萃取得到的NEPP质量分数(mg/g),即溶剂对去除EPP蓝莓粉的NEPP萃取率,以此作为衡量酸法提取NEPP工艺效果的指标.实验均平行操作3次,取平均值.设定了料液比、温度、时间、萃取液浓度、萃取液种类等5个单因素进行实验.

1.3.4 响应面优化实验

在单因素实验基础上,选取较优的因素和水平,采用响应面分析方法对工艺条件进行优化.根据Box-Benhnken原理,选取影响NEPP萃取率的合适因素和水平,进行响应面分析优化.

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果分析

2.1.1 萃取液种类和浓度对NEPP萃取率的影响

固定料液比(质量浓度,g/mL)1∶20,温度70℃,加热时间10 h,研究萃取液种类(乙醇/硫酸和甲醇/硫酸)及萃取液浓度(体积比为90/10,95/5,97/3)对蓝莓粉中NEPP萃取率的影响,结果见图1.

图1 萃取液种类和浓度对NEPP萃取率的影响Fig.1 Effect of extracted solution and concentration on NEPP yield

从图1可以看出,甲醇/硫酸的萃取效果要优于乙醇/硫酸,因此在下一步实验中固定选取甲醇/硫酸作为萃取溶剂.由于甲醇/硫酸的体积比对NEPP的萃取率影响不大,下一步实验中固定甲醇/硫酸体积比为90/10.因此在响应面分析中萃取液种类和萃取液浓度这2个参数不作为考察因素.

2.1.2 料液比对NEPP萃取率的影响

图2 料液比对NEPP萃取率的影响Fig.2 Effect of material-to-liquid ratio on NEPP yield

固定萃取溶剂为甲醇/硫酸(90/10,体积比),温度70℃,加热时间10 h,选择不同的料液比(质量浓度,g/mL)1∶5,1∶10,1∶15,1∶20,1∶25,研究料液比对NEPP萃取率的影响,结果见图2.

由图2可以看出,在料液比(质量浓度,g/mL)1∶5至1∶15范围内NEPP的萃取率明显升高,而在1∶15至1∶25范围内,NEPP的提取有上升的趋势,但是差别不大.根据实验结果,我们选择料液比(质量浓度,g/mL)1∶15,1∶10,1∶25这3个水平进行响应面分析.

2.1.3 萃取温度对NEPP萃取率的影响

固定萃取溶剂为甲醇/硫酸(90/10,体积比),料液比(质量浓度,g/mL)1∶20,加热时间10 h,选择不同的加热温度50,60,70,80,90℃,研究加热温度对NEPP萃取率的影响,结果见图3.

图3 萃取温度对NEPP萃取率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on NEPP yield

从图3可以看出,NEPP的萃取率随着温度的升高而升高,90℃时提取效果最好.根据实验结果,我们选择萃取温度70,80,90℃3个水平进行响应面分析.

2.1.4 萃取时间对NEPP萃取率的影响

固定萃取溶剂为甲醇/硫酸(90/10,体积比),料液比(质量浓度,g/mL)1∶20,温度70℃,研究加热时间10,15,20,25 h对NEPP萃取率的影响,结果见图4.

图4 萃取时间对NEPP萃取率的影响Fig.4 Effect of extraction time on NEPP yield

由图4可以看出,当加热时间为20 h时,NEPP的萃取率达到最大,随着加热时间的继续延长,NEPP的萃取率基本没有变化.根据实验结果,选择加热时间15,20,25 h 3个水平进行响应面分析.

2.2 响应面实验对工艺参数的优化

2.2.1 响应面实验设计

综合单因素实验,选取对NEPP萃取率影响较大的时间、温度、料液比3个因素,确定了相应的3个水平,见表1.进行响应面分析方法,确定NEPP的最优提取方法,见表2和图5.并对实验结果进行响应面分析,得到如下回归方程和方差分析结果,见表3.

表1 响应面分析因素水平表Tab.1 Factors and levels in response surface analysis

表2 响应面分析方案及结果Tab.2 Analysis results of response surface methodology

用响应面软件分析得出NEPP萃取率的回归方程为

式中X1为温度,X2为时间,X3为料液比,Y为NEPP萃取率.

表3 回归方程方差分析Tab.3 Analysis and statistical parameters of regression model

由表3可得出,除了温度和料液比的交互作用不显著外,其他项都显著.失拟项不显著,表明方程对实验得拟合程度很好,相关系数R2=0.993 5,表明99.35%的数据可以用此方程解释[12].综合上述,此方程能很好的分析和预测所建模型,模拟真实的3因素3水平分析可行.各因素的影响程度从大到小依次为温度、时间、料液比.温度的影响最大,P值小于0.000 1,其次为时间P值0.000 4,料液比P值为0.000 5,温度和料液比的交互作用不显著P值大于0.05.

2.2.2 响应面图分析

从图5a可以看出,温度的变化曲面较陡,说明温度对NEPP萃取率的影响较大,随着温度的升高NEPP萃取率先高后低,在80℃左右达到最大值.时间的变化曲面较缓,说明时间对NEPP萃取率的影响相对较小.从等高线曲线可以看出,沿温度轴向等高线密集,而时间轴向等高线相对稀疏,说明温度对NEPP萃取率的响应值较时间影响大.等高线呈椭圆形,说明温度和时间的交互作用强,影响显著[13-15].

从图5b可以看出,料液比、温度都是先增后降,料液比(质量浓度,g/mL)1∶20左右达到最大值,温度在80℃左右达到最大值.从等高线图可以看出,温度轴向的等高线密集,说明温度对NEPP萃取率的响应值影响大,料液比轴向的等高线相对稀疏,说明料液比对NEPP萃取率的响应值比温度影响小[16].

从图5c可以看出,料液比的变化曲面和时间的变化曲面都比较陡峭,说明这两者对NEPP萃取率影响都较大.两者的交互作用成椭圆,说明两者的交互作用强,这与方差分析结果一致.从等高线图来看,时间轴向等高线密集,料液比轴向的等高线较时间轴向相对稀疏,说明时间影响相对较大,这与方差分析结果一致.

2.2.3 最佳工艺验证实验

为验证回归模型的可靠性,以响应面得到的最佳数值进行验证实验,温度为73.88℃,时间为22.67 h,料液比(质量浓度,g/mL)为1∶20.62,预计值为26.19 mg/g.在实际实验过程中取了该最佳条件的相似条件,温度取74℃,时间取22.5 h,料液比(质量浓度,g/mL)取1∶21进行3次平行实验,进行了验证实验,NEPP在不含EPP蓝莓粉的萃取率为27.25 mg/g,和预测值很相近,证明最佳实验条件最优.

3 结 论

通过单因素实验确定了蓝莓NEPP提取的萃取溶剂及浓度为甲醇/硫酸(90/10,体积比),温度为70～90℃,时间为15～25 h,料液比(质量浓度,g/mL)为1∶15 ～1∶20.

图5 温度、时间、料液比对NEPP萃取率的影响Fig.5 NEPP as affetcted by temperature,time and soid/liquid ratio

通过料液比、萃取温度、时间这3个因素进行响应面分析,建立NEPP萃取率的回归方程,结果表明这3个因素都对NEPP萃取率影响显著,影响顺序由大到小依次为温度,时间,料液比.R2=0.993 5,模型拟合度好.通过响应面分析确定出的最佳提取条件为温度74℃,时间22.5 h,料液比(质量浓度,g/mL)1∶21,在该条件下通过实验不含EPP蓝莓粉中NEPP萃取率达27.25 mg/g.

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