HPLC法测定“化腐生肤”渗滤液中β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁的含量

赵 莉田 徽* 李崇进阮期平谭承佳

（1 绵阳师范学院 分子生物学与生物制药重点实验室，四川 绵阳 621000；2. 绵阳市人民医院，四川 绵阳 621000）

HPLC法测定“化腐生肤”渗滤液中β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁的含量

赵 莉1田 徽1* 李崇进2阮期平1谭承佳1

（1 绵阳师范学院 分子生物学与生物制药重点实验室，四川 绵阳 621000；2. 绵阳市人民医院，四川 绵阳 621000）

目的 建立用高效液相色谱法测定“化腐生肤”渗滤液中β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁的含量，为其制定质量标准提供依据。方法 色谱柱为Diamonsil C18（250 mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈-甲酸水（78∶22），流速为1.0mL/min，检测波长为275nm，柱温30℃。结果 β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁在0.0276～0.1935mg/mL范围内线性良好（r=0.9998），平均回收率均在95%～105%，RSD为2.223%，“化腐生肤” 渗滤液中β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁含量为0.3866 mg/mL。结论 该方法准确，简便灵敏，可用于“化腐生肤” 渗滤液的质量控制。

高效液相色谱；化腐生肤；β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁

“化腐生肤方”是由紫草、生大黄、白芷、川芎、黄柏等药材按一定的比例组成，具有“化腐生肤，排脓解毒，活血止痛”的功效，其在绵阳市人民医院已临床应用十余年，治愈了5000余例烧烫伤患者，治愈率达96%。课题组前期发现极性较低的石油醚部位及氯仿部位为“化腐生肤方”治疗烧烫伤作用的有效部位[1]。为了进一步开发“化腐生肤方”，建立其提取物的质量控制标准，根据β，β’-二甲基丙烯酰阿卡宁是君药紫草的指标性成分[2]，本实验建立了采用HPLC法测定“化腐生肤方”的渗滤液中β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁的方法，为其的进一步开发研究奠定基础。

1 材 料

1.1 仪器

Agilent1100高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；BP211D 型电子天平（德国赛多利斯公司）；KH-600DB型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）。

1.2 药材及试剂

紫草、黄芩、川芎、当归、生大黄、黄柏、白芷等中药材购于四川诚隆药业，经鉴实均系中国药典一部（2010年版）收载正品。β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁对照品（中国药品生物制品检定所，批号111689-200501）；色谱乙腈（美国fisher公司）

2 实验方法

2.1 供试品溶液的制备

按“化腐生肤方”比例取各药材，粉碎后过2号药典筛，用95%乙醇浸渍6h后，以5mL/min/kg的速度渗漉并收集10倍量渗漉液吸取渗漉液3mL，放于烧杯中，在60℃以下烘干，用乙腈定容至10mL，摇匀，备用。

2.2 对照品溶液的制备

精确量称取β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁标准品13.800mg，置于50mL小烧杯中，加入分析乙腈溶解后转入50mL容量瓶中，定容至刻度，浓度为0.276mg/mL。

2.3 色谱条件

色谱柱为DIKMA公司Diamonsil C18（250 mm×4.6mm，5μm）；流动相为乙腈：甲酸水（78∶22）；检测波长为275nm，柱温为30℃，流速为1.0mL/min，进样量为10uL。理论板数按β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁峰计算应不低于2000。

2.4 方法学考察

2.4.1 方法专属性考察

在上述色谱条件下，考察色谱峰分离度并比较阴性实验色谱图。

2.4.2 线性关系的考察

精密吸取β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁对照品溶液1、2、3、4、5、6、7mL至10mL容量瓶中，定容至刻度线，注入液相色谱仪，记录峰面积。以峰面积为纵坐标与对照品进样浓度（mg/mL）为横坐标进行线性回归。

2.4.3 精密度实验

精确吸取0.276mg/mL的β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁标溶液，连续进样五次测定，计算精密度。

2.4.4 稳定度实验

取供试品溶液，每隔2h进样测定，计算稳定度。

图1 标准品HPLC图

图2 样品HPLC图

图3 阴性对照HPLC图

表1 标准曲线的数据

2.4.5 重复性实验

平行制备5份供试品溶液，分别进样测定，计算稳定度。

2.4.6 回收率实验

取已知含量样品3mL，共3份，精密吸取β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁对照品1mL、2mL、3mL，按供试品制备定容到10mL，制备9份溶液，进行测定，通过高效液相色谱法测定，计算回收率。

2.4 样品溶液含量测定

取3批样品，按以上方法测定渗滤液中β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁含量。

3 实验结果

3.1 方法专属性

在上述色谱条件下，标准品在17.886min时出峰，分离效果较好，见图1～图3。

3.2 方法学考察结果

3.2.1 标准曲线

实验结果见表1，由标准曲线数据求得直线回归方程为：y=10314x-137.48（r=0.9998），表明β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁的浓度在0.0276～0.1935mg/mL范围内，与吸收峰面积具有良好的线性关系。

3.2.2 精密度实验结果

实验结果见表2，由结果可见该实验方法的精密性高。

表2 精密度实验结果

3.2.3 稳定度实验结果

实验结果见表3，由结果可见供试品溶液在8h内较稳定。

3.2.4 重复性实验结果

实验结果见表4，由结果可见该实验的重复性结果良好。

表3 稳定性试验结果

表4 重复性试验结果

3.2.5 回收率实验结果

实验结果见表5，由结果可见该实验的回收率结果良好。

3.3 样品溶液含量测定

取3批样品，测定结果见表6。

表5 加样回收率试验结果

表6 样品溶液含量试验结果

4 讨 论

含量测定是中药提取工艺质量标准的关键内容之一。对于复方制剂而言，应根据处方的功能主治及所含成分选择合适的测定指标，尽量体现含量测定指标与药物安全性、有效性的关联。尽管测定的成分仅占制剂的很小一部分，但只要指标选择恰当，也是质量控制的重要手段。

“化腐生肤方”根据临床及有效部位筛选实验的结果，选定渗漉法进行提取。其渗漉法以乙醇为溶媒提取到的有效成分含量较高，有利于含量的测定。课题组前期曾考察过其渗漉工艺，因此本实验选用渗漉液作为含量测定的对象。

对于“化腐生肤方”，紫草为方中主要药材，其性味苦寒，归心包络、肝经，具有凉血活血、消炎止疼、解毒透疹之功，用于血热毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、疮疡、湿疹、水火烫伤等症的治疗，能清热燥湿，泻火解毒。现代医学有抗菌、抗炎、抗癌等作用。其功效可部分反映整个成方制剂的功效，且用量较大，能反映药品的内在质量，故选紫草作为含量测定的药材。β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁是紫草的活性成分，所以该实验以标准品为对照，对其提取物里的β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁含量进行测定。关于该成分的含量测定，文献报道多采用高效液相法[3-5]，该法简便准确，灵敏度高，重现性好，故以β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁作为本品提取工艺质量控制的指标成分之一，以便高效地来控制整个成方制剂的质量。

总之，本实验的结果良好，建立的方法准确，简便灵敏，可用于“化腐生肤” 渗滤液的质量控制。本实验为进一步开发基于“化腐生肤方”的中药新药奠定了坚实基础。

[1] 田徽,阮期平,李崇进,等.“化腐生肤方”抗实验性烧烫伤及抗炎镇痛抑菌有效部位的药理筛选[J].中药材,2011,34(1):111-115.

[2] 中华人民共和国药典委员会编.中国药典(2010年版·一部)[S].北京:化学工业出版社,2010:238-239.

[3] 潘秀琴,徐淑卿.紫草中有效成分提取方法的研究[J].医药世界, 2006,8(5):81-82.

[4] 赵华,游勇基.紫草药材化学成分的测定[J].海峡药学,2007,19 (4):35-38.

[5] 杨秀芳.正交实验法优选紫草的提取工艺[J].中成药,2005,27(3): 351-353.

Determinating Content of β, β-dimethylacryl Alkannin in Leachate of Huafushengfu by HPLC

ZAHO Li1, TIAN Hui1, LI Chong-jin2, RUAN Qi-ping1, Tan Chen-jia1
(1 Key Laboratory for Molecular Biology and Biopharmaceutic, Mianyang Normal University, Mianyang 621000, China; 2 Mianyang People's Hospital, Mianyang 621000, China)

Objective To develop a RP-HPLC method to determinat the content of leachate β, β-dimethylacrylalkannin in Huafushengfu,and provide the basis for the development of quality standards. Methods The coulmn was Diamonsil C18(250 mm×4.6mm, 5μm);the mobile phase was acetonitrileformic acid(78∶22); the flow-rate was set at 1.0 mL/min;the detection wevelength was 275nm and column temperature was 30 ℃. Results β, β-dimethylacrylalkannin had good linearity in the range of 0.0276～0.1935mg/mL(r=0.9998).The average recovery was 95%～105%. The RSD was 2.223 %.The content of leachate β, β-dimethylacrylalkannin in " Huafushengfu was 0.3866 mg/mL. Conclusion This method is rapid,simple and sensitive,and it can be using as the quality control of Huafushengfu.

HPLC; Huafushengfu; β, β-dimethylacrylalkannin

R644

B

1671-8194（2013）28-0002-03

2009年绵阳市科技计划项目（09S002-6）

*通讯作者：E-mail：tianhui1009@126.com