GDF-15基因-3148C/G位点多态性与冠心病风险的相关性分析

尚小森陈小平马云霞李鹏丽

（1 山西医科大学研究生学院内科学研究生，山西 太原 030001；2 太原市中心医院心内科，山西 太原 030009；3 太原市中心医院中心实验室，山西 太原 030009）

GDF-15基因-3148C/G位点多态性与冠心病风险的相关性分析

尚小森1陈小平2马云霞3李鹏丽3

（1 山西医科大学研究生学院内科学研究生，山西 太原 030001；2 太原市中心医院心内科，山西 太原 030009；3 太原市中心医院中心实验室，山西 太原 030009）

目的 探讨 GDF-15 基因 -3148C/G 位点多态性与山西地区汉族人群中冠心病发病风险的相关性。方法 采用聚合酶链反应 -限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）的方法对 118 例冠心病患者和 56 例健康对照者 GDF-15 基因 -3148C/G 位点进行多态性分析。结果 在冠心病组中，CC、GC 两种基因型频率分别为 76.27% 和 23.73%，在正常对照组中分别为 60.71% 和 39.29%；两组受试者 -3148C/G 位点的 CC、GC 基因型频率分布有统计学意义（χ2=4.488，P=0.034）；风险基因型为 GC 型，OR=2.080，95% 可信区间为 1.050 ～ 4.121。结论 GDF-15 基因 -3148C/G 位点中 GC 基因型与山西地区汉族人群中冠心病的发病风险存在一定的相关性。

冠心病；生长分化因子 -15（GDF-15）；基因多态性；聚合酶链反应 -限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）

随着我国人口老龄化及生活方式的改变，冠心病已成为严重威胁人类健康的疾病之一。生长分化因子-15（GDF-15）的基因定位于染色体19p12～13.1，由两个外显子组成，被一个长约1800个碱基对的内含子分隔开来[1]。近年来，GDF-15基因在心血管疾病领域已有初步研究，Wang[2]于2007年发现GDF-15基因-3148C/G多态性与左心室重塑相关，但GDF-15基因-3148C/G位点多态性与冠心病发病风险的相关性报道甚少。

本研究以冠心病患者为主要研究对象，对GDF-15基因-3148C/G位点多态性进行检测，从分子水平上探索GDF-15基因-3148C/G多态性与山西地区汉族人群中冠心病的发病风险之间的关系。

1 资料与方法

1.1 病例选择

2012年1月至2012年12月间，于太原市中心医院心内科病房住院行冠脉造影并诊断冠心病的患者作为冠心病组即实验组，签署知情同意书，在冠脉造影的同时采取动脉血标本。同期进行健康体检者作为对照组。

排除有急、慢性炎症性疾病的临床或实验室表现者；肿瘤性疾病；瓣膜疾病、心肌病；无固定冠脉狭窄的变异性心绞痛；X综合征；冠状动脉扩张；严重的肾脏疾病（血CR＞2.5mg/dL）；严重的肝脏疾病（ALT高于正常水平2倍）。

1.2 方法

1.2.1 冠状动脉造影及侧枝血管评判

按Judkins 法行选择性冠状动脉造影。任何主要冠状动脉（左主干、左前降支、右冠状动脉、回旋支、主要的对角支或钝缘支）的管腔直径狭窄50%以上为有意义的冠脉狭窄。

1.2.2 实验分组

所有受试者分为冠心病组和正常对照组。冠脉造影检查冠脉管腔直径狭窄50%以上作为实验组118例；同期进行健康体检者作为对照组56例。

1.2.3 DNA的提取

采集患者静脉外周血2～4mL，EDTA-K2抗凝，用全血基因组DNA提取试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）提取全血基因组DNA，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，于-20℃保存备用。

1.2.4 PCR扩增

查阅相关文献设计GDF15基因引物，由上海生工生物技术有限公司合成。引物序列为：-3148C/G F：5'-AGTGAGTCCTTGTGTCTCT TAC-3'；R：5'-GCAGGCTGGTGTAGAGTC-3'。扩增体系：体系总体积为40μL，其中10×Buffer 4μL，MgCl2 3μL，dNTP（2.5mM）4μL，上下游引物（10μM）各2μL，Taq 酶（1U）2μL，DNA模板2μL，ddH2O 21μL。反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 7min。取5μL PCR产物，1.5%琼脂糖电泳检测扩增结果，PCR扩增产物10μL进行酶切，其余25μL送上海生工测序。

1.2.5 酶切及产物鉴定

图2 冠心病组中-3148位点基因型（a：GC 基因型；b：CC 基因型）

图3 对照组中-3148位点基因型（a：GC基因型；b：CC基因型）

PCR产物于59℃12h酶切。反应体系：总体积为20μL，其中PCR产物10μL，10×Buffer 2μL，BsrI限制性内切酶0.5μL。取15µl加有10×loding buffer的酶切产物，加样至含有溴化乙锭的2.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像仪分析酶切结果。

1.2.6 序列比对

测序结果采用DNAMAN以及Chromas生物软件进行分析。

1.2.7 统计学分析

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示，应用t检验；基因型分布是否符合Hardy Weinberg 遗传平衡定律以及组间基因频率、等位基因比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 基本资料

所有受试者基本资料（年龄、性别、吸烟史、高脂血症、高血压病、糖尿病、家族史）见表1。经卡方检验，冠心病组和对照组差别无统计学意义（P＞0.05）。

表1 基线资料比较

表2 两组受试者GDF-15基因-3148C/G位点基因频数和等位基因频率比较

2.2 GDF-15基因的Hardy Weinberg 遗传平衡定律检验

经χ2检验，两组受试者GDF-15基因的-3148C/G位点均符合Hardy Weinberg 遗传平衡定律（P＞0.05），具有群体代表性。

2.3 PCR扩增及酶切结果分析

GDF-15基因PCR扩增产物大小为251bp，CC型酶切产物大小为251bp，GC型酶切产物大小为251bp、191bp、60bp（图1）；经统计,在冠心病患者中CC型和GC型分别为90例和28例，正常健康者中CC型和GC型分别为34例和22例。

图1 GDF-15基因-3148C/G酶切结果M：DL500 DNA marker；1：PCR扩增产物；2：CC基因型；3：GC基因型

2.4 序列比对结果

采用DNAMAN和Chromas生物软件对测序结果进行分析，测序结果与酶切结果一致，在实验组中存在GC型和CC型（图2），同样，在对照组中也存在该两种基因型（图3）。

2.5 实验组与对照组受试者GDF-15基因-3148C/G位点基因型分布频率及等位基因频率的比较（表2）

CC、GC基因型频率在实验组中分别为76.27%、23.73%；在对照组中分别为60.71%、39.29%；两组受试者的-3148C/G位点的CC、GC基因型频率分布有统计学意义（χ2=4.488，P=0.034）；但两组C、G等位基因频率比较无统计学意义（χ2=2.389，P=0.122）。风险基因型为GC型，OR=2.080，95%可信区间为1.050～4.121，对于两组的基因型分布而言，-3148C/G位点的GC基因型有显著增加患冠心病的风险。

3 讨 论

冠心病是世界范围内致病率和致死率居首位的复杂性疾病，在我国每年死于冠心病超过70万人。冠心病是由于动脉粥样硬化引起血管狭窄、冠状动脉供血不足导致心肌功能障碍和器质性病变，该过程由遗传因素和坏境因素共同导致。但国内关于冠心病的遗传因素报道甚少。目前大量研究表明GDF-15不但参与心肌缺血的发生发展过程，而且能够减轻由此引起的心肌损伤，发挥保护性作用。GDF-15在正常的心肌细胞中不表达，在心肌细胞局部缺血和再灌注，或压力负荷过重等应激状态下，在心肌细胞表达增高[3]。GDF-15是转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族的成员之一[4]。起初，人们发现GDF-15参与了肿瘤的发生和发展，调控肿瘤的生长，抑制肿瘤的转移[5]。近来，研究表明GDF-15还是一个重要的心血管保护因子。虽然心脏在正常情况下不表达GDF-15，但是当心脏处于多种病理状态，如后负荷升高刺激、缺血/再灌注损伤时，GDF-15在心肌细胞被迅速诱导高表达[6,7]。成熟的GDF-15蛋自被分泌到细胞外后，与心肌细胞表面TGF-β家族受体结合，激活Akl、SMAD等下游信号通路，反馈抑制心肌的损伤[7]。

由此可知，GDF-15与冠心病的关系密切。近年来，GDF-15基因多态性在心血管领域已有研究，2007年，Wang[3]报道了GDF-15基因-3148C/G位点多态性与高血压患者左心室重塑之间的相关性。但对于该位点与冠心病之间的相关性报道甚少。

本研究以山西地区汉族人群中冠心病患者118例以及同期进行健康体检者56例为研究对象，采用病例对照研究设计探讨GDF-15基因-3148C/G位点多态性与冠心病发病风险之间的关系，实验观察到：-3148C/G位点的实验组和对照组均检出两组基因型，即CC和GC，经统计证明，CC、GC基因型在实验组和正常对照组中差异有显著性（P＜0.05），其中CC基因型为正常野生型基因，GC基因型可能是冠心病患病的危险因素，携带有GC基因型的人群患冠心病的风险比CC基因型者升高2.080倍，但本研究中，两组-3148位点的等位基因频率比较差异无统计学意义，这可能是本研究样本量较少，并不能代表整个山西地区人群的基因分布情况，仍需加大样本量做进一步的研究。

综上所述，GDF-15基因-3148C/G位点的多态性与冠心病的发病相关，其中GC基因型与该病的发病关系更为紧密，可作为预测冠心病患病的生物学指标。但样本含量相对较少，具有一定的局限性，因此并不一定能真实的代表整个山西地区汉族人群中该多态性位点与冠心病发病风险的关系，有待扩大样本后进一步验证。

[1]Lawton LN,Bonaldo MF,Jelenc PC,et al.Identification of a novel member of the TGF-beta superfamily highly expressed in human placenta[J].Gene,1997,203(1):17-26.

[2]王晓建.生长分化因子15的基因多态保护原发性高血压患者左心室重塑[J].中国协和医科大学[D].2007.

[3]Kempf T,Eden M,Strelau J,et al.The transforming growth factor-ß super family member growth-differentiation factor-15 protects the heart from ischemia/reperfusion injury[J].Circ Res,2006,98(3): 351-360.

[4]BootcovMR,Bauskin AR,Valenzuela SM,et al.MIC-l,a novel macrophage inhibitory cytokine,is a divergent member of the TGF-βsuper family.[J]Pro Natl Acad Sci USA,1997:94(21):11514-11519.

[5]Bauskin AR,Brown DA,Kuffner T.et al.Role of macrophage inhibitory cytokine-1 tumorigenesis and diagnosis of cancer[J].Cancer Res,2006,66(10):4983-4986.

[6]Xu J,Kimball TR,Lorenz JN,et al.GDF15/MIC-1 functions as a protective and antihypertrophic factor released from the myocardium in association with SMAD protein activation[J].Circ Res, 2006,98(3):342-350.

[7]Zimmers TA,Jin X,Hsiao EC,et al.Growth differentiation factor-15/macrophage inhibitory cytokine-1 induction after kidney and lung injury[J].Shoek,2005:23(6):543-548.

Correlation of GDF-15 Gene -3148C/G Polymorphism and the Risk of Coronary Heart Disease

SHANG Xiao-sen1, CHEN Xiao-ping2, MA Yun-xia3, LI Peng-li3
(1 Graduate of Heart Diseases, Graduate Department, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China; 2 Department of Cardiology, Taiyuan Central Hospital, Taiyuan 030009, China; 3 Department of Laboratory, Taiyuan Central Hospital, Taiyuan 030009, China)

ObjectiveThis study is to explore the correlation between polymorphism of -3148C/G site of GDF15 gene and the risk of coronary heart disease(CHD) in Shanxi Han people.MethodsThe polymerase chain reaction (PCR )、gene sequencing and sequence flanking were used to detect and analyze the polymorphism of -3148C/G site of GDF-15 gene for 118 cases CHD patients as experimental group and 56 cases patients as control group.ResultsThe genotype frequencies of CC、GC were 76.27% and 23.73% in the CHD group and in the control group were 60.71% and 39.29% respectively. Testers of the two groups at -3148C/G CC, GC genotype frequencies distribution have a statistics mean (χ2=4.488,P=0.034);The risk genotype was GC, OR=2.080, 95% of confident interval is 1.050-4.121.ConclusionsWe conclude that there is a correlation between the polymorphism of -3148C/G site in GDF15 gene and the risk of CHD patients in Shanxi Han people.

Coronary heart disease(CHD); GDF-15; Gene polymorphisms ; PCR-RFLP

R541.4

：B

：1671-8194（2013）04-0030-03