Hedgehog 信号通路中Gli－1 蛋白在食管鳞癌中的表达及意义

鞠雷，甄伟，臧东钰

(1.辽宁医学院附属第三医院，辽宁 锦州 121001;2.盘锦市中心医院，辽宁 盘锦 124000;3.辽东学院，辽宁 丹东 118000)

我国食管癌的发病率和死亡率高居世界首位［1］。尽管我国食管癌的诊断和治疗水平处于世界领先地位，但综合5 年生存率也在30% 左右，其根本原因还是无法做到早期诊断、早期治疗。Hedgehog (Hh)信号传导通路是一个经典的胚胎发育信号通路［2］，近年研究发现它在多种肿瘤的发生、分化、侵袭和转移中起关键性作用［3］。本实验应用免疫组织化学技术，探讨Hh 信号通路中核转录因子Gli－1 的异常激活与食管鳞癌间的关系，力争为食管鳞癌的早期诊断和治疗提供新的思路和线索。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂 50 例食管鳞癌及癌旁组织标本取自辽宁医学院附属第三和第一医院2010—2012年手术切除存档蜡块。患者均为男性，年龄49～75 岁，平均62 岁。Gli－1 兔多克隆抗体购自美国Santa Cruz 公司，SABC 试剂盒购自武汉博士德生物制品有限公司。

1.2 免疫组织化学染色 所有石蜡切片脱蜡水化，抗原修复，3%H2O2孵育，滴加一抗(1 ∶50)，4℃湿盒过夜，滴加二抗，37 ℃温箱20 min，滴加SABC 液，37 ℃温箱30 min，DAB 显色，苏木素复染细胞核，脱水，透明，二甲苯封片。用已知的阳性对照片做阳性对照，PBS 代替一抗作阴性对照，光学显微镜下观察并摄片。

1.3 结果判定 Gli－1 蛋白以胞质或胞核出现浅黄色至深棕色颗粒判断为阳性细胞。随机选取10个高倍视野，分别计数200 个细胞。以染色强度结合阳性细胞百分比综合计分进行定性分析。(1)计数阳性细胞占细胞总数的百分比并分级，0～5%、5～25%、25～50%和＞50%分别对应0、1、2 和3 分;(2)根据阳性细胞的着色强弱分级，阴性、浅黄色、棕色和深棕色分别对应0、1、2 和3 分。两项评分相加后进行判断，0 分、1～2 分、3～4 分和5～6 分分别对应－ (阴性)、 + (弱阳性)、+ + (中度阳性)和+ + + (强阳性)。我们判定+ + / + + +为异常表达。

1.4 统计学处理 应用SPSS13.0 统计软件进行卡方检验。

2 结 果

2.1 免疫组织化学结果 Gli－1 蛋白主要表达在胞质或胞核，它在癌旁组织中表达较弱，但在鳞癌中表达明显增强，二者比较有显著性差异(图1)。

2.2 Gli－1 在ESC 中的表达与临床病例特征的关系 Gli－1 在ESC 及PC 中的表达与患者的年龄、病变部位无显著相关(P ＞0.05)，但Gli－1 在ESC 中的表达与肿瘤分化程度、TNM 分期密切相关(表1)。

表1 50例患者Gli－1 蛋白在食管鳞癌及癌旁组织中的表达与临床病例特征的关系

3 讨 论

近年来发现，一些在胚胎发育、细胞分化过程中起重要调控作用的信号传导通路 (如Wnt、Norch、TGF 及Hedghoge 等)，在食管癌的发生、发展中也起着重要作用。Hh 信号传导通路是一个经典的胚胎发育信号通路，但在多种肿瘤组织中都存在Hh 信号通路的异常激活［4－6］，尤其是其上游配体Shh 和下游转录因子Gli－1 不同程度的激活，可以使得肿瘤细胞更具有侵袭性和转移能力［7］。因此本实验采用免疫组织化学技术并结合临床资料，研究Hh 通路中Gli－1 蛋白在食管鳞癌中的表达及意义，以探讨Hh 信号转导通路的异常激活与食管鳞癌之间的关系。

Hh 信号通路主要由Hh 配体与膜蛋白受体Ptch 及Smo 组成复合物，其下游包含Gli、Fu、Su(Fu)等许多分子。当Hh 大量存在时，Ptch 可与Shh 结合并解除对Smo 的抑制作用，Smo 可与信号通路下游的因子SU、FU 及Gli 等结合，使Gli 活化并进入细胞核，进而调节多种靶基因的表达。Gli 家族在脊椎动物中包括Gli－1、Gli－2 和Gli－3 三种转录因子。Gli－1 主要起激活目的基因转录的作用，同时也是该信号通路下游的目的基因分子，肿瘤组织中Gli－1mRNA 表达上调是该信号通路异常活化的标志［8］。Kogerman 等［9］报道，阻止Gli－1 入核可以抑制目标基因的转录激活，表明Gli－1 入核对于Hh 信号通路运作非常重要。本实验结果发现，Gli－1 蛋白主要表达在胞质和胞核，它在癌旁食管组织中表达较低，但在癌组织中的表达明显增强，而且随着分化程度的降低和TNM 分期的升高，Gli－1 蛋白的表达逐渐增强。因此我们认为，在食管鳞癌的发生、发展过程中可能存在Hh 信号通路的异常激活。

许多参与肿瘤细胞增殖与扩散的效应分子均源于Hh 信号通路的靶基因或下游分子，且Hh 信号通路与其它调控肿瘤细胞分化、增殖的信号通路也有着交叉作用。因此，深入研究Hh 信号传导通路与食管癌发生、发展的关系，对进一步提高食管癌的诊断和治疗水平具有重要意义。

图1 Gli－1 在食管鳞癌中的表达 ×400

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