电针对绝经后骨质疏松症模型大鼠肠黏膜钙结合蛋白-D9k mRNA和蛋白表达的影响

葛伟,唐曦,欧阳钢,莫非,侯立皓,娄青林,顾刘宝



电针对绝经后骨质疏松症模型大鼠肠黏膜钙结合蛋白-D9k mRNA和蛋白表达的影响

葛伟1,唐曦2,欧阳钢1,莫非1,侯立皓1,娄青林1,顾刘宝1

(1.江苏省省级机关医院,南京 210024;2.重庆医科大学,重庆 400016)

观察电针对去卵巢大鼠模型肠黏膜钙结合蛋白-D9k(CaBP-D9K)mRNA和蛋白表达的影响,探讨针灸治疗绝经后骨质疏松症可能机制。将60只3月龄SD健康雌性大鼠随机分为手术组和假手术组,3个月造模成功后将手术组随机分为模型组、假电针组、电针组、药物组。干预治疗12星期后,测定腰椎及股骨骨密度(BMD),然后处死大鼠,提取小肠黏膜,采用荧光实时定量PCR和Western blotting检测CaBP-D9K mRNA和蛋白表达。成功复制绝经后骨质疏松症模型,经电针组和药物组干预治疗12星期后,其大鼠骨密度与模型组相比均有明显提高,荧光实时定量PCR和Western blotting检测结果显示电针组和药物组大鼠小肠黏膜CaBP-D9K mRNA和蛋白表达上调,但电针组上调CaBP-D9K mRNA的水平不及药物组。针灸治疗绝经后骨质疏松症机制之一可能与上调小肠黏膜CaBP-D9K mRNA和蛋白表达量,从而增强肠钙吸收有关。

针刺疗法;电针;骨质疏松症,绝经后;钙结合蛋白-D9k;大鼠

绝经后骨质疏松症是临床上中老年女性的一种常见病、多发病,其发病原因有很多,研究证实,妇女绝经后的骨量快速丢失,除外因绝经后所致的雌激素下降外,钙及维生素D等营养物质的生物可用性低,肠钙吸收障碍也是绝经后骨质疏松症产生的重要原因之一[1-2]。笔者前期的研究证实针灸对骨质疏松症有良好的治疗效果[3-4],针灸的治疗效果是否是通过增强机体的脾胃功能,从而提高了机体内钙及维生素D等营养物质的生物利用度,为此笔者观察了针刺对去卵巢大鼠模型肠黏膜钙结合蛋白-D9k(CaBP-D9K)mRNA和蛋白表达的影响,从分子水平探讨针刺防治绝经后骨质疏松症的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验设备

韩氏电针仪由南京济生医疗科技有限公司提供; Discovery-A骨密度仪由美国HOLOGIC公司提供;高速离心机由德国Eppendorf公司提供;Model680酶标仪由美国伯乐公司提供;0.20 mm×13 mm针灸针由无锡佳健医疗器械有限公司提供;164-5051型Western电泳仪由美国Bio-Rad公司提供。

1.2 药物与试剂

苯甲酸雌二醇注射液由上海通用药业股份有限公司生产,规格为1 mg/mL;TRIzol试剂和BBI第一链cDNA合成试剂盒购自invitrogen公司,引物由上海生工生物工程服务有限公司设计并合成;CaBP-D9K试剂盒购自Thermo Scientific公司。引物序列设计如下,CaBP-D9K基因上游: 5'-GATAAGAACGGTGATGGAGAAGT-3';CaBP-D9K基因下游:5'-TCAATCAGTAGGTGGTGTCGG-3';探针: 5'-CAAAAAGTTATCACAATGAAGCCAGAA-3';GAPDH对照基因上游:5'-AAGTTCAACGGCACAGTCAAG-3';GAPDH对照基因下游:5'-CCAGTAGACTCCACGACATACTCA-3',探针: 5'-ACCCATCACCATCTTCCAGGAG-3'。

1.3 动物造模

用3%戊巴比妥钠(按0.1 mL/100 g)经大鼠腹腔注射麻醉后,于背部正中切口进入腹腔背侧,完整摘除双侧卵巢后,仔细止血,逐层缝合。假手术组取腰椎旁背侧切口,进入腹腔,切除一段小肠系膜后,立即止血缝合。动物手术后给予抗生素3 d,防止感染,自由摄食,饮水。3个月后进行骨密度检测确定造模是否成功[5]。

1.4 分组及治疗方法

选取60只3月龄Sprague Dawley(SD)雌性清洁级大鼠,体重为180～200 g。未曾交配,购于上海斯莱克实验动物有限责任公司,实验动物使用许可证号为SCXK(沪)2007-0005。动物适应饲养1星期后,随机分成A、B两组,其中A组为假手术组,共15只,不切除双侧卵巢;B组为实验组,共45只,切除双侧卵巢。3个月后进行骨密度检测确定造模成功后,两组各取5只摘除眼球取血后处死,提取骨标本保存。将A组余下的10只大鼠设为假手术组;B组余下的40只大鼠随机分为模型组、假电针组、电针组和药物组,每组10只。

1.4.1 电针组

造模成功后,大鼠不作麻醉,在自己设计的鼠架上进行针灸操作。取穴分两组,①关元、三阴交(双);②肾俞、后三里(双)。每日选取其中一组穴位,二组穴位交替进行,取穴方法按华兴邦的方法实施,用细美容针刺入穴位后,接韩氏电针仪进行电针刺激,其刺激参数为连续脉冲波,频率为3～4 Hz,强度为4～5 mA,以动物局部轻度抖动为度,每次20 min。每日1次,连续治疗3个月。

1.4.2 假电针组

穴位和针刺操作同电针组,连接电针仪但不打开电针仪开关。

1.4.3 药物组

造模成功后,按人鼠剂量换算,每只大鼠每次以0.1 mg/kg皮下注射苯甲酸雌二醇,每3 d注射1次,连续治疗3个月。

1.4.4 假手术组

同模型组不作任何处理。

5组大鼠治疗3个月后进行骨密度的检测,处死大鼠,摘除眼球取血,分离血清,置于﹣20℃冰箱保存集中待测。提取小肠黏膜于﹣70℃冰箱冻存备用。

1.5 观察指标

1.5.1 骨密度

大鼠处死前应用美国产HOLOGIC Discovery-A骨密度仪及所附小动物梯级标准模型和分析软件在体扫描,计算出大鼠全身及腰椎及股骨的骨密度。

1.5.2 小肠黏膜标本取样

采用5%苯巴比妥钠麻醉大鼠,腹部常规消毒后,打开腹腔,从十二指肠起始端剪下约10 cm小肠,无菌生理盐水冲洗干净后,剪刀纵行剪开肠腔,用烤过的载玻片刮下肠黏膜,置于Trizol中,另一部分,用锡铂纸包裹,迅速置于盛有液氮的容器中,﹣70℃冰箱冻存备用。

1.5.3 Real time-PCR检测CaBP-D9K mRNA

①总RNA提取。在小肠黏膜组织中加1 mL Trizol充分匀浆;加入0.2 mL氯仿,4℃离心后取上清,加入0.5 mL异丙醇离心后加入1 mL75%乙醇,洗涤沉淀, ﹣20℃保存备用;②cDNA合成。取5mL RNA加入5mL DEPC水,再加入1mL Random Primer p(dN)6,70℃水浴5 min,立即置于冰中。逆转录(RT)反应体系为ddH2O 11mL,5×Buffer 4.0mL,dNTP 2.0mL, RNasin 1.0mL,AMV 2.0mL。置RT反应体系依次于37℃水浴5 min,42℃水浴60 min,70°C水浴10 min后将标本置﹣20℃保存。③荧光定量PCR。GAPDH作为内参,PCR反应体系为ddH2O 9mL,2×HS qPCR Master Mix 12.5mL,上下游引物各0.5mL,Taq酶0.5mL,标本cDNA模板2.0mL。反应条件为95℃ 2 min, 95℃ 10 s,60℃ 40 s,40个循环。④PCR结果采用2-K法代表基因的相对表达倍数,ΔΔCT法为A=CT(目的基因,待测样本)－CT(内参基因,待测样本);B=CT(目的基因,对照样本)－CT(内参基因,对照样本)。K=A－B。

1.5.4 Western blotting检测CaBP-D9K蛋白

在小肠黏膜组织中加入400mL裂解液,充分裂解后4℃离心,﹣70℃保存备检。将纯化的蛋白样品在12% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,浓缩胶80 V 30 min,分离胶100 V 90 min;电泳后转PVDF膜。用含有5%脱脂奶粉Tris缓冲液封闭4℃过夜;加入抗CaBP-D9K抗体(1:400)后4℃过夜;洗膜后加入1:5000稀释的HRP二抗,室温孵育2 h;洗膜后曝光显影。

1.6 统计学方法

使用SPSS13.0软件进行统计,数据采用均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析。以＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠骨质疏松模型判断

大鼠双侧卵巢摘除3个月后,模型组大鼠腰椎和股骨的骨密度较假手术组明显降低,两组比较差异具有统计学意义(＜0.05),提示骨质疏松模型造模成功。详见表1。

表1 两组造模后腰椎和股骨体骨密度比较(±s,g/cm2)

注:与假手术组比较1)＜0.O5

2.2 各组治疗后股骨近端及腰椎体BMD比较

电针组治疗后腰椎骨密度与模型组比较,差异具有统计学意义(＜0.05)。药物组和非手术组治疗后腰椎及股骨骨密度与模型组比较,差异均具有统计学意义(＜0.05)。电针组治疗后腰椎骨密度与药物组比较,差异具有统计学意义(＜0.05),提示药物组提高大鼠腰椎骨密度效果优于电针组。详见表2。

表2 各组治疗后股骨近端及腰椎体骨密度比较 (±s,g/cm2)

注:与模型组比较1)＜0.O5;与药物组比较2)＜0.O5

2.3 电针刺激对大鼠小肠黏膜CaBP-D9K mRNA表达的影响

表3 各组治疗后小肠黏膜CaBP-D9K mRNA表达及CaBP-D9K蛋白表达比较 (±s)

注:与模型组比较1)＜0.O1;与药物组比较2)＜0.O1

电针组、药物组和假手术组治疗后小肠黏膜组织CaBP-D9K mRNA表达及CaBP-D9K蛋白表达与模型组比较,差异均具有统计学意义(＜0.05)。电针组治疗后小肠黏膜组织CaBP-D9K mRNA表达与药物组比较,差异具有统计学意义(＜0.01)。详见表3。

3 讨论

绝经后骨质疏松症的发病原因有很多,大量的流行病学和研究均证实,妇女绝经后的骨量快速丢失,除外因绝经后卵巢功能下降而导致雌激素水平下降外,肠钙吸收障碍是绝经后骨质疏松症产生的重要原因之一[1-2]。肠钙吸收是一个复杂的生理、生化过程,它包括被动扩散过程和主动跨细胞转运过程。正常情况下,肠道钙吸收以主动转运为主,也就是需要肠道的CaBP-D9K协助。CaBP-D9K是一种受活性维生素D调节的机体内钙的重要转运蛋白,分子量为9000,其含量高低直接影响到钙、磷吸收代谢,进而影响骨骼发育。研究发现小肠上皮细胞内CaBP含量与肠钙吸收量呈正相关,因此普遍认为CaBP-D9K在肠钙吸收过程中起着重要作用[6]。钙进入细胞主要是通过细胞膜上钙通道,顺电化学梯度而进行。进入胞浆后,钙结合蛋白马上与进入的钙离子结合,促进钙离子从刷状缘膜侧向基底膜转运亦即跨细胞转运,加快钙离子在细胞内的扩散,从而促进钙离子在小肠的吸收[7]。

绝经后骨质疏松症大多为中老年患者,随着年龄的增长,其消化吸收功能呈逐年下降的趋势[8],肠黏膜组织中CaBP随着年龄增加也缓慢下降,临床研究证实70岁时肠钙吸收率较青年时期减少近50%,这也是绝经后骨质疏松症高发原因之一[9],因此提高肠黏膜组织中CaBP的活性和含量,从而提高肠钙吸收率对防治骨质疏松症具有非常重要的意义。

中医学认为,肾主骨,骨质疏松症的发生与肾虚有密切关系,另外,绝经后骨质疏松症患者消化吸收功能下降主要是由于脾胃虚弱,化生水谷精微功能下降所致,鉴于绝经后骨质疏松症患者多有脾肾俱虚的病理特点,笔者在临床上多选用具有补肾健脾作用的肾俞、关元俞、足三里、三阴交等为主的腧穴进行针灸治疗,在临床上收到较好效果[1-2],因此本实验选用关元、三阴交、肾俞、后三里4个腧穴,对通过去卵巢建立的绝经后骨质疏松症大鼠模型进行针灸干预,结果显示,与模型组相比较,电针组能明显提高模型大鼠的骨密度(＜0.05),表明针灸疗法具有良好的抗骨质疏松症的作用。另外在本研究中,绝经后骨质疏松症模型与假手术组大鼠比较,其小肠黏膜组织CaBP-D9K表达明显下降,与文献报道[10]结果一致。电针组与模型组比较,大鼠小肠黏膜组织CaBP-D9K基因和蛋白表达均明显提高,其差异均有统计学意义(＜0.01)。由于CaBP-D9K是促进肠钙吸收的重要物质,在骨质疏松症的发生中具有重要作用,据此笔者推测,针灸良好的抗骨质疏松症的作用可能是通过增强小肠黏膜组织CaBP-D9K基因和蛋白表达,提高了钙及其它营养物质的生物利用度,从而增强了胃肠对营养物质的吸收功能实现的。另外,笔者在本课题研究中设计了假电针组以观察非常规的针灸治疗是否对骨质疏松症模型大鼠产生影响,结果表明假电针组大鼠小肠黏膜组织CaBP-D9K基因和蛋白表达有一定的提高,但与模型组比较差异无统计学意义(＞0.05),表明针灸治疗取效需要达到一定的刺激量才有可能产生效果。

[1] Pignotti GA, Genaro PS, Pinheiro MM,. Is a lower dose of vitamin D supplementation enough to increase 25 (OH)D status in a sunny country?[J]. Eur J Nutr, 2009,49(5):277-283.

[2] Obermayer-Pietsch BM, Gugatschka M, Reitter S,. Adult-type hypolactasia and calcium availability: decreased calcium intake or impaired calcium absorption?[J]. Osteoporos Int, 2007,18(4):445- 451.

[3] 欧阳钢,王玲玲,卓铁军,等.不同刺激方法对原发性骨质疏松症骨密度的影响[J].中国针灸,2004,24(1):49-50.

[4] 欧阳钢,王东岩,徐小梅.针灸配合药物治疗男性骨质疏松症疗效观察[J].中国针灸,2011,31(1):23-25.

[5] 吴启跃,马雯,余正红,等.骨质疏松两种造模方法的对照研究[J].中国中医骨伤科杂志,2007,15(8):17-19.

[6] Song Y, Kato S, Fleet JC. Vitamin D receptor (VDR) knockout mice reveal VDR-independent regulation of intestinal calcium absorption and ECaC2 and calbindin D9k mRNA[J]. J Nutr, 2003,133(2):374- 380.

[7] Schroeder B, Dahl MR, Breves G. Duodenal Ca2﹢absorption is not stimulated by calcitriol during early postnatal development of pigs [J]. Am J Physiol, 1998,275(2):305-313.

[8] Kalu DN, Chen C. Ovariectomized murine model of postmenopausal calcium malabsorption[J]. J Bone Miner Res, 1999,14(4):593-601.

[9] 孟迅吾.钙与骨质疏松症[J].中华内科杂志,2005,44 (3):235-236.

[10] van Abel M, Hoenderop JG, van der Kemp AW,. Regulation of the epithelial Ca2﹢channels in small intestine as studied by quantitative mRNA detection[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2003,285(1):78-85.

Effect of Electroacupuncture on the Expressions of CaBP-D9K mRNA and Protein in Intestinal Mucosa in a Rat Model of Postmenopausal Osteoporosis

1,2,1,1,-1,-1,-1.

1.,210024,; 2.,400016,

To investigate the effect of electroacupuncture on the expressions of calcium binding protein-D9k (CaBP-D9K) mRNA and protein in intestinal mucosa of ovariectomized rats and explore a possible mechanism for acupuncture treatment of postmenopausal osteoporosis.Sixty 3-month-old healthy female SD rats were randomly allocated to operation and sham operation groups. Following successful model making after 3 months, the operation group was randomly allocated to model, sham electroacupuncture, electroacupuncture and medication groups. Lumbar vertebral and femoral bone mineral density (BMD) was measured after 12 weeks of interventional treatment. The rats were then sacrificed. Small intestinal mucosa was taken. The expressions of CaBP-D9K mRNA and protein were examined using real time fluorescence quantitative PCR and Western blotting.A model of postmenopausal osteoporosis was made successfully. After 12 weeks of interventional treatment, bone mineral density was increased significantly in the electroacupuncture and medication groups compared with the model group. The results of measurement using real time fluorescence quantitative PCR and Western blotting showed that the expressions of CaBP-D9K mRNA and protein in small intestinal mucosa were up-regulated in the electroacupuncture and medication groups of rats, but the level of up-regulation of CaBP-D9K mRNA was lower in the electroacupuncture group than in the medication group.One of the mechanisms of acupuncture treatment for postmenopausal osteoporosis may be that up-regulated expressions of CaBP-D9K mRNA and protein in small intestinal mucosa increase intestinal absorption of calcium.

Acupuncture therapy; Electroacupuncture; Osteoporosis, Postmenopausal; Calcium binding protein-D9k; Rats

R2-03

A

10.3969/j.issn.1005-0957.2013.11.944

1005-0957(2013)11-0944-04

国家自然科学基金项目(81072850)

葛伟(1983 - ),男,住院医师

欧阳钢(1966 - ),男,主任医师,硕士生导师,E-mail:oygang@sina.com.cn

2013-07-26