MicroRNA-31在食管鳞状细胞癌中的表达及其与预后的关系

浙江省肿瘤医院，浙江省肿瘤研究所，

浙江省胸部肿瘤(肺、食管)诊治技术研究重点实验室，浙江 杭州310022

MicroRNA-31在食管鳞状细胞癌中的表达及其与预后的关系

罗君 凌志强 彭兵锋 袁嘉敏 郑智国 毛伟敏

浙江省肿瘤医院，浙江省肿瘤研究所，

浙江省胸部肿瘤(肺、食管)诊治技术研究重点实验室，浙江 杭州310022

背景与目的：研究发现，许多微小RNA(microRNAs，miRNAs)与恶性肿瘤密切相关，其中miR-31(microRNA-31)在许多肿瘤中呈异常改变。中国是食管鳞状上皮细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)最高发的地区之一。本研究旨在调查miR-31在ESCC中的表达水平与临床病理学因素以及预后的关系。方法：采用实时反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR)技术检测食管癌细胞株KYSE410、EC1和EC9706，以及81例ESCC组织和癌旁正常组织中miR-31的表达水平。结果与临床资料和随访结果结合作统计分析。结果：在3株ESCC细胞株以及75.31%的ESCC组织中，miR-31表达上调。并且miR-31的高表达与更严重的淋巴结转移(P=0.043)、更深的浸润深度(P=0.002)以及更晚期的病理分期有关(P=0.027)，而与其他临床病理学因素无关(P＞0.05)。此外，miR-31的高表达与较差的无进展生存期(progression-free survival，PFS)有关(Kaplan-Meier分析P=0.014，多变量Cox分析P=0.021)。结论：miR-31可能是ESCC一项新的诊断和预后评价指标。

食管鳞状细胞癌；miR-31；临床病理学；生存期

食管癌是常见的消化道肿瘤，其发生率排在全世界恶性肿瘤的第七位，病死率居第六位［1］。中国是食管癌高发区，每年全球50%的食管癌发生在中国，而其中约90%是食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)。大部分ESCC直到疾病的晚期症状都不明显，因此此类患者往往诊断晚、预后差、死亡率高。人们亟需找到能够在病变早期被特异性识别的分子标志，以有效地帮助早期诊断和判断预后，但目前对这种“完美”的分子标志的探索尚未成功［2］。

微小RNA(micro-RNA，miRNA)是一类长约21～25个核苷酸的高度保守的非编码单链小分子RNA，由相应的基因编码，转录加工形成，通过调控靶基因的表达，产生转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing)。miRNA在细胞增殖、凋亡、发展和分化中起重要的调控作用，并与肿瘤的发病和进展关系密切。而在业已发现的众多miRNA中，miR-31被认为是调控肿瘤恶性生物学行为的重要基因之一［3］。本研究应用实时RT-PCR技术，分别检测ESCC细胞株及手术切除标本中miR-31的表达水平，并结合临床病理资料及生存分析，探讨miR-31在ESCC发生、发展及预后中的潜在作用。

1 材料和方法

1.1 材料

人食管癌细胞株KYSE410、EC1及EC9706为本所保存，正常食管上皮细胞采用癌旁正常组织中分离的细胞原代培养72 h获得。本实验采用81例ESCC组织及相应癌旁正常组织，均来自于2009年2月—2010年9月浙江省肿瘤医院食管癌手术后组织标本，均经病理诊断为鳞状细胞癌，标本的使用得到医院伦理委员会批准。其中51例标本手术切除后立即取材，癌组织取自手术切除标本中肉眼观察的肿瘤组织，癌旁正常组织标本取自距肿瘤边缘至少5 cm处的肉眼下无瘤组织。另30例标本于手术切除后快速液氮冷冻储存，后经显微病理切割手工分类。所有肿瘤及正常组织标本收集后储存于-80 ℃冰箱中以备RNA提取。肿瘤分级、TNM分期按照国际抗癌联盟(international union against cancer，UICC)2009年第七版食管癌分期标准：其中高、中分化65例，低分化16例；Ⅰ、Ⅱ期34例，Ⅲ、Ⅳ期47例；伴有淋巴结转移50例，无淋巴结转移31例。81例肿瘤患者中，男性70例，女性11例，年龄40～74岁，平均59.7岁，其中≥60岁41例，＜60岁40例。术前均未接受化疗或放疗。电话随访截止2011年10月10日，其中失访5例(6.17%)，失访者在生存分析中以最后有效随访日期作为截尾值处理。

细胞培养用RPMI-1640培养基、胎牛血清均购自Gibco公司。RNA提取试剂盒miRNeasy迷你试剂盒(编码：130171813)购于Qiagen公司，琼脂糖、0.5% TBE液、EB液、逆转录试剂盒PrimeScript®miRNA cDNA 合成试剂盒 (编码：D350A)和real time RT-PCR试剂盒SYBR®Premix Ex Taq™Ⅱ (编码：DRR081A)购于TaKaRa公司。引物由上海Invitrogen公司合成。实时RT-PCR上游引物序列：mir-31：5’-AGGCAAGATGCTGGCATAGCT-3’，内参基因RNU6B(U6 small nuclear RNA)：5’-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3’，下游通用引物由逆转录试剂盒PrimeScript®miRNA cDNA合成试剂盒提供。

1.2 细胞培养

3株食管癌细胞培养于含15%胎牛血清、青霉素100 mg/L、链霉素100 mg/L的RPMI-1640培养液中，细胞置于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养，每隔2～3 d传代1次，取指数生长期细胞用于试验。

1.3 总RNA提取

按照miRNeasy迷你试剂盒的说明书提取肿瘤细胞及组织中的总RNA，紫外分光光度计测量，判定所取总RNA的浓度和纯度，要求光密度值A260/A280＞1.8。取1 µL RNA溶液与1.5%的变性琼脂糖凝胶中进行电泳，测定RNA的完整性。

1.4 逆转录

取1 µg总RNA使用PrimeScript®miRNA cDNA合成试剂盒进行cDNA的合成，具体操作参照使用说明。

1.5 PCR扩增

实时RT-PCR的PCR扩增及熔解曲线分析均使用ABI 7500PCR仪(Applied Biosystems)，采用20 µL的反应体系，每个样本重复3次，求平均Ct值作为实验结果。具体操作参照SYBR®Premix Ex Taq™Ⅱ的使用说明。反应过程具体为：50 ℃激活聚合酶2 min，95 ℃预变性1 min；95 ℃变性5 s，60 ℃退火和延伸34 s，扩增40个循环。结束后通过95 ℃15 s，60 ℃ 1 min，85 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s制作熔解曲线。RT-PCR结果按照2-ΔΔCT法［4］进行处理：首先获取每个样本中miR-31及内参基因RNU6B的Ct值，计算ΔCT=Ct(miR-31)-Ct(U6)；再根据ΔΔCT=ΔCT(肿瘤组织/细胞)-ΔCT(癌旁正常组织/细胞)，进一步计算mir-31在肿瘤组织与癌旁正常组织之间表达倍数的差异：若ΔΔCT＜0，则表达升高2-ΔΔCT倍；若ΔΔCT≥0，则表达降低2ΔΔCT倍。

1.6 统计学处理

应用SPSS 17.0统计学软件，各组间miR-31表达倍数均值的差异采用独立样本t检验分析，生存曲线绘制用乘积极限法(Kaplan-Meier)进行单因素生存分析，对数秩检验(Log-Rank test)进行生存曲线比较，多因素分析采用Cox比例风险模型。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-31在ESCC中的表达与临床病理学参数的关系

在81例ESCC标本中，61例(75.31%)出现了相对于癌旁正常食管组织的不同程度的miR-31表达上调，20例(24.69%)表现出miR-31的表达下调。其中最高的表达上调489.85倍，最低的表达下调28.70倍，平均表达上调29.58倍。57例(70.37%)癌组织中的miR-31表达高于癌旁正常组织2倍以上(图1)。3株食管癌细胞株与正常食管上皮细胞相比，miR-31均出现了明显上调，其中在KYSE410中高表达110.59倍、在EC1中高表达77.05倍，而在EC9706中高表达51.92倍(图2)。将miR-31在癌和(或)癌旁正常组织中的差异性表达倍数与临床病理参数比较。结果发现miR-31在肿瘤中的高表达与浸润深度、淋巴结转移及病理分期有关：浸润深度超过肌层的食管癌组织相比未超过肌层的食管癌组织，miR-31的表达提高约27倍(P=0.002)；有淋巴结转移的癌组织相比无淋巴结转移的癌组织，miR-31的表达提高约4倍(P=0.043)；而miR-31在Ⅲ、Ⅳ期食管癌组织中较Ⅰ、Ⅱ期表达提高约5倍(P=0.027)。另外，miR-31的表达水平与性别、年龄、肿瘤长径、是否存在神经浸润以及分化程度差异无统计学意义(P＞0.05，表1)。结合流行病学资料分析，miR-31与吸烟、饮酒及肿瘤家族史亦无统计学意义(P＞0.05)。

图 1 miR-31在ESCC组织/正常组织中的表达水平(n=81)Fig. 1 Level of miR-31 in ESCC tissue compared to normal tissue (n=81)

图 2 miR-31在ESCC细胞株KYSE410、EC1、EC9706中的表达水平Fig. 2 Relative expression level of miR-31 in ESCC cell lines (KYSE410, EC1 and EC9706) compared to normal esophageal epithelial cells

2.2 miR-31在ESCC中的表达与预后的关系

以miR-31在ESCC组织中表达提高是否超过2倍为标准，将所有患者分为miR-31高表达组及miR-31未高表达组。两组间在性别、年龄、吸烟史、饮酒史及家族史等因素方面差异无统计学意义(P＞0.05)。根据电话随访结果，以复发、转移或死亡代表肿瘤进展事件，分别统计两组的无进展生存期(progression-free survival，PFS)。Kaplan-Meier分析提示，miR-31高表达组的平均PFS为(16.30±1.39)个月，而miR-31未高表达组为(20.30±1.27)个月，差异有统计学意义(χ2=6.031，P=0.014，图3)，说明miR-31表达未超过2倍者有显著的无进展生存优势。进一步行Cox回归分析显示，miR-31表达未超过2倍者有独立的无进展生存优势(RR=2.546，95%CI:1.154～5.614，P=0.021)，而年龄、性别、侵润深度、淋巴结是否转移、病理分期等却均与患者预期PFS无显著相关性(P＞0.05)。

图 3 不同miR-31表达水平的ESCC患者的PFSFig. 3 The progression free survival (PFS) curves according to different miR-31 expression levels in ESCC

表 1 miR-31在食管鳞癌组织中的异常表达与临床病理参数的关系Tab. 1 Relationship of miR-31’s abnormal expression and clinicopathological factors in ESCC tissues

3 讨 论

许多研究表明，miRNA在调节肿瘤相关基因表达的同时，其本身也具有癌基因或抑癌基因的特点。其中某些miRNA，如miR-21在大多数肿瘤中呈现高水平表达，并充当癌基因的角色［5］。而miR-31却在不同的肿瘤中存在不同水平的表达。Valastyan等［6］发现miR-31能介导乳腺癌肺部转移灶荷瘤的减小，抑制其表达能提高乳腺癌细胞的活动性、侵袭性及抗凋亡能力。因此研究者认为miR-31在乳腺癌中是一种降低转移发生率的抑癌基因。而miR-31在结肠癌中表达的提高却促进了肿瘤侵袭性［7］，因此又被认为具有癌基因特点。

miR-31在不同肿瘤中存在截然不同的表达，这一看似矛盾现象在许多相关实验中均有报道。例如miR-31在结直肠癌［8］、肺癌［9］及口腔癌［10］中一般处于高表达水平，而在胃癌［11］、乳腺癌［12］及卵巢癌［13］中则显著低表达。即便同是食管癌中，miR-31在腺癌和鳞癌的表达水平也不尽相同。Leidner等［14］研究Barrett化生与食管腺癌演进关系时发现，miR-31在腺癌和高级别异型增生组织中的表达较Barrett食管中明显下调，因此推断miR-31可能具有抑制食管腺癌发生的作用。而本研究却在食管鳞癌中发现miR-31较正常组织表达上调，因此推测其可能具有促进肿瘤发生的作用。可以看出，miR-31并非在所有肿瘤中都呈现高表达或低表达状态。在鳞状细胞癌中，miR-31大都为高表达，而在泌尿生殖系统肿瘤中往往呈低表达。上述现象提示人们不能排除该基因存在组织特异性的可能［15］。若此假想成立，其原因可能是因为所有类型的细胞都具有分泌和接受miRNA的能力，同一细胞可分泌多种miRNA，而一种miRNA则能调节多个基因的翻译。因此miR-31的信号传递方式可以是双向或多向的，这与传统的细胞间信号单向传递不同。在某特定肿瘤组织中，若miR-31调控的抑癌因素占主要地位，则miR-31展现出抑癌倾向；反之则展现出促癌倾向。对于本身不编码蛋白的miRNA来说，其靶基因的性质往往决定了其组织特异性。

本研究中的81例ESCC手术切除标本中，57例(70.37%)癌组织miR-31的表达高于正常组织2倍以上，在3株食管癌细胞中的表达更是上调超过50倍。这一数据与Zhang等［16］的报道较为符合(30/45，66.7%)，进一步验证了miR-31在ESCC中特异性表达升高，有癌基因倾向。另外发现：肿瘤浸润越深，miR-31表达越高(P=0.002)；病理分期越晚，miR-31表达越高(P=0.027)；在有淋巴结转移的癌组织中，miR-21表达比无淋巴结转移的癌组织中更高(P=0.043)。TNM分期是公认的评估肿瘤进展、转移情况以及预测预后的指标，因此miR-31可能也具有一定的评估及预测作用。Zhang等［16］报道了miR-31与临床病理学因素的关系，揭示miR-31在晚期肿瘤患者中表达更高。相比而言，本研究除病理分期和淋巴结转移以外，还发现了miR-31与侵润深度的关系，进一步提示miR-31可能对ESCC的侵袭及转移具有促进作用。Wang等［17］报道在结直肠癌中也存在miR-31表达提高，并且其高表达与TNM分期及浸润深度呈正相关，这一现象与ESCC中相似。而另一些恶性肿瘤中则可见与本实验不同的结果，Zhang等［18］在胃癌中发现miR-31表达明显下调，虽差异无统计学意义(P＞0.05)，但仍可看出其下调与TNM因素呈一定的负相关。miRNA调控作为一种表观遗传学现象，是否受到环境因素的影响，导致其靶基因发生致瘤性的改变。Xi等［19］发现，香烟烟雾冷凝液可诱导正常呼吸道上皮及肺癌组织中的miR-31表达提高，增加肺癌细胞的增殖性和致瘤性，因此认为miR-31与吸烟史以及肺癌的发生相关。但在本研究中miR-31与吸烟、饮酒及肿瘤家族史并无明显相关性(P＞0.05)。

有关miR-31的异常表达与肿瘤患者生存期的关系，不同的肿瘤研究结果不同。在乳腺癌中miR-31的高表达可提高患者生存时间［6］；而本研究中，高表达的miR-31不但与较差的PFS显著相关，而且还超过了浸润深度、淋巴结转移及病理分期等因素对PFS的影响，成为ESCC独立的危险因素。相比其他研究中针对总生存期进行统计分析，本研究着眼于PFS，能更为客观地评判肿瘤相关生存水平。

综上所述，miR-31的表达上调在ESCC中是一高频分子事件，与患者的淋巴结转移、浸润深度、病理分期及不良预后显著相关，提示miR-31可作为ESCC早期诊断及评估预后的候选指标之一。相信随着表观遗传学研究的不断深入，有关miR-31以及更多肿瘤相关性miRNA的分子机制及临床价值会被人们进一步了解。

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The expression of microRNA-31 in esophageal squamous cell carcinoma and its prognostic value

LUO Jun, LING Zhi-qiang, PENG Bing-feng, YUAN Jia-min, ZHENG Zhi-guo, MAO Wei-min (Zhejiang Province Cancer Hospital, Zhejiang Cancer Research Institure, Zhejiang Key Laboratory of the Diagnosis and Treatment Technology on Thoracic Oncology, Hangzhou Zhejiang 310022, China)

LING Zhi-qiang E-mail: lingzq@hotmail.com

Background and purpose: It was reported that many microRNAs (miRNAs) have close relation with carcinomas. miR-31 (microRNA-31) shows abnormal change in numerous cancers. China is one of the most high-risk areas of esophageal squamous cell carcinoma (ESCC). The aim of the present study was to investigate the expression of miR-31 in ESCC, and analyze the relationship of its expression with clinicopathological features and prognosis. Methods: The expression of miR-31 in KYSE410, EC1 and EC9706 cell lines, as well as 81 cases of ESCC tissues and adjacent normal esophageal tissues were detected by real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). The result was combined with clinical and follow-up data and statistical analysis was conducted. Results: MiR-31 was up-expression in 3 cell lines and 75.31% of the ESCC tissues. miR-31 up-expression was positively related to severer lymph node metastasis (P=0.043), deeper invasion of tumors (P=0.002) and advanced pathological stage (P=0.027). There was no relationship of miR-31 with other clinicopathological features (P＞0.05). Furthermore, high expression of miR-31 was associated with poor progression-free survival (PFS) in 81 ESCC patients by Kaplan-Meier analysis (P=0.014) and by multivariate Cox analysis (P=0.021). Conclusion: Our results identified miR-31 may be a new diagnostic criteria and prognostic biomarker for ESCC.

Esophageal squamous cell carcinoma; miR-31; Clinicopathology; Survival

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.07.002

R735.1

：A

：1007-3639(2013)07-0487-06

2013-02-25

2013-04-25）

卫生部科研基金(No：WKJ2010-2-004)；浙江省自然基金项目(No：Y2091110)。

凌志强 E-mail:lingzq@hotmail.com