新型冷热交替热物理治疗肿瘤的生物学效应研究

任晓敏，刘苹,

1 上海交通大学生物医学工程学院，上海市，200240

2 上海交通大学Med-X研究院，上海市，200030

0 引言

肿瘤是发病率、致死率最高的常见病、多发病之一[2]。目前肿瘤治疗如手术、放疗和化疗，效果还不理想，且副作用很大[3-5]。特别对于已发生转移的肿瘤，几乎没有有效的治疗方法。由于恶性肿瘤血管异常增生，与正常血管相比，管壁薄弱、分化程度低，缺乏平滑肌及完整的基底膜结构，内皮细胞之间存在较大缝隙，通透性强，更有利于肿瘤细胞穿透血管壁形成远端转移灶[6-7]。针对目前肿瘤治疗现状，迫切需要寻求新型的肿瘤治疗方法。

大多数恶性肿瘤都会引起不同程度的免疫抑制，以利于肿瘤逃避机体免疫监视和攻击, 促进肿瘤发展[8-9]。髓源性免疫抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells, MDSCs）高表达髓系分化抗原GR1和CD11b（GR1+CD11b+细胞），在荷瘤鼠和肿瘤病人中大量增加，引起机体的免疫抑制。MDSCs参与肿瘤免疫逃逸的方式可概括为两个方面，一方面MDSCs可以表达多种促血管形成因子直接促进肿瘤血管的形成。MDSCs细胞的浸润介导了肿瘤对抗血管生成治疗产生不应性，使得抗血管生成疗法的失效[10]。另一方面MDSCs可以通过表达高水平的ARG1、iNOS和ROS来抑制T细胞介导的特异性抗肿瘤免疫，诱导调节性T细胞(regulatory T cells, Tregs)产生及抑制NK和巨噬细胞介导的天然抗肿瘤免疫[11]。MDSCs已被认为是引起肿瘤动物试验及临床病人免疫治疗失败的主要因素。中华医学提示我们，“药要向内求”。疾病治愈的根本应该在于机体系统对于外界干预的应答能力。所以肿瘤治疗的新思路应该是局部治疗的同时，是否最大程度的解除机体免疫抑制状态。

热物理治疗是通过外界能量介入体内破坏肿瘤的治疗方法。与传统治疗方法相比较，它通过短时间内实现极高温或极低温达到破坏肿瘤组织，具有微创性和副作用小等优势。且研究表明，热疗时可调控包括抗原提呈细胞（APCs）、T细胞和自然杀伤细胞（NK）的活性[12-13]。热刺激还可以导致坏死的肿瘤细胞释放一些损伤相关的分子模式分子（damageassociated molecular pattern molecule，DAMP），诱导机体抗肿瘤免疫反应。然而，单独冷疗和热疗仍然存在一些局限性[14-15]，大大限制了两者在临床上的应用。我们设计并研制了一套新型的液氮射频冷热交替热物理治疗系统[1]。在前期研究中，基于小鼠4T1乳腺癌裸鼠脊背视窗模型，发现冷热交替治疗相对于热疗或冷疗对肿瘤新生血管具有更强的破坏能力[16]。另外建立了皮下高转移性4T1小鼠乳腺癌模型，该肿瘤模型在生长21 d即在脾脏、肺部形成微转移灶[17]。经过冷热交替治疗后，存活率明显提高，且治疗后无复发，小鼠血清内Th1型细胞因子的含量明显上升[18]，提示可能激起了机体的抗肿瘤免疫响应。此免疫响应不但使原位肿瘤消融，而且抑制了已经存在的微转移[19]。但目前对其治疗机制还不清楚。

基于前期的研究，提出如下假说：通过应用非极限温度进行冷热交替局部刺激肿瘤组织，在短时间内物理性地破坏大量肿瘤细胞和肿瘤微循环，释放肿瘤特异性抗原而激活免疫相关因子，然后促进递呈细胞的活化和抗原传递，及外周淋巴结迁移，解除免疫细胞MDSCs对机体抗肿瘤免疫的抑制，从而协同激活机体的特异性抗肿瘤免疫响应，达到由肿瘤局部治疗到全身系统性的治疗的效果。本文以4T1乳腺癌为模型，研究肿瘤局部治疗后，原位肿瘤的损伤及对外周血和脾脏中免疫抑制细胞MDSCs的影响。Micro-CT成像观察肿瘤血管的损伤，苏木素伊红染色研究肿瘤组织坏死；流式细胞术分析外周血中MDSCs的改变以及免疫荧光研究脾脏中MDSCs浸润的变化；同时进行治疗后三个月的疗效观察，分析冷热交替治疗可能存在的机制。

1 材料和方法

1.1 动物、细胞系及主要试剂

6～8周龄SPF级Balb/c雌性小鼠（上海斯莱克动物中心），饲养在独立换气盒笼中，人工控制12小时昼夜变换光照。小鼠自由摄取60Co辐射灭菌的饲料及高温灭菌水。小鼠4T1乳腺癌细胞（上海市第一人民医院馈赠），培养在加有10%的新生胎牛血清（杭州四季清有限公司）及双抗（100 U/mL青霉素、100 g/mL链霉素）（上海生工生物工程技术服务有限公司）的RPMI1640培养基中（美国Hyclone公司）。超细沉淀硫酸钡颗粒购于上海泽文贸易有限公司。用于流式细胞术和免疫荧光的抗体FITC标记的CD11b和PE标记的Gr-1购于Biolegend公司。苏木素和伊红溶液购自上海虹桥乐翔医用试剂有限公司。

1.2 4T1乳腺癌模型的建立及肿瘤大小的测定

制备1×106U/ 0.1 mL 4T1细胞悬液置于冰上待用。按0.5 mL/100 g小鼠体重腹腔注射0.016 g/mL戊巴比妥钠对动物进行麻醉，在小鼠背部皮下注射0.1 mL细胞悬液。肿瘤接种21 d后，游标卡尺测量肿瘤体积，按如下公式计算：V (cm3) =π×肿瘤长轴(cm) ×肿瘤短轴(cm) × 肿瘤高度(cm) / 6。随机将荷瘤小鼠分为荷瘤对照组，温热组和冷热交替治疗组。

1.3 冷热交替治疗

1.3.1 实验方案

在实验中共包括三组：荷瘤对照组、温热组和冷热交替治疗组。实验内容如下：(1) 肿瘤血管损伤：治疗1 h后，每组3只小鼠，比较不同组肿瘤血管的损伤；(2) 肿瘤组织病理分析：治疗1 h后，每组3只小鼠，分析原位肿瘤组织损伤；(3) MDSCs的变化：治疗24 d后，每组3只小鼠，流式细胞术分析外周血中MDSCs以及脾脏组织切片分析脾脏组织中MDSCs的变化；(4) 存活率：每组8只小鼠，治疗后3个月观察各组小鼠的生活状态，分析小鼠存活时间。

1.3.2 冷热交替治疗系统

采用实验室自主研发的冷热交替治疗系统[1]。该系统包括液氮制冷和射频加热两个模块，如图1所示。在治疗过程中，为了减小接触阻抗并确保治疗剂量的统一性，设计了专门适用于该系统的圆形探针，见图2。并且此探针适合本实验的体表肿瘤模型[20]。

1.3.3 实验过程

图1 冷热交替治疗系统示意图[1]Fig.1 Sketch of the alternate thermal system[1]

肿瘤接种21 d时进行治疗，治疗前测量肿瘤体积，此时平均值为0.2 cm3。治疗前，将荷瘤小鼠随机分为三组：荷瘤对照组、温热组和冷热交替组。首先对需要治疗的小鼠麻醉，然后用酒精和碘酊对肿瘤部位消毒。

治疗时，探针贴在肿瘤表面，将一根测温用的热电偶插入肿瘤基底部。温热治疗采用射频加热，将肿瘤的温度加热至50oC(热电偶所测的温度)，并保持15 min。冷热交替治疗分为三个过程：(1)冷冻 用液氮致冷的方法将肿瘤温度降至-20oC，保持5 min；(2)复温 冷冻治疗后，等待肿瘤自然复温至10oC左右；(3) 加热 复温过程结束，射频加热将肿瘤温度升至 50oC，保持10 min。治疗完成后，将三组小鼠各分为4部分，用于不同的实验研究。

图2 冷热交替治疗探针[20]Fig.2 The treatment probe of alternate thermal system[20]

1.4 肿瘤新生血管观察

利用微血管造影技术，以硫酸钡为造影剂，Micro-CT成像，评价不同治疗方式引起肿瘤血管的损伤程度。取超细沉淀硫酸钡颗粒溶于0.3 g/ml的生理盐水中，充分溶解后，用超声波粉碎机超声20 min以上得到合适的硫酸钡造影剂待用。治疗1 h后，小鼠麻醉，用硫酸钡造影剂对小鼠进行心脏灌注。灌注结束，将肿瘤取下，福尔马林固定、干燥，Micro-CT(Xredia, MicroXCT-200, Inc., USA)成像。成像参数如下：管电压，30 kVp；管电流，200 μA；分辨率，2.5 μm～3 μm；曝光时间，15 s；球管距离，35 mm；探测距离：24 mm；层厚，1.83 μm；层距，0；像素，0.001 83 mm；体素，1.83 μm × 1.83 μm×1.83 μm；扫描视野，1.78 mm ×1.78 mm。投影张数1 500张。重建得到三维结果。

1.5 苏木素伊红染色（HE）

将冷冻保存的各组肿瘤组织从-80oC冰箱取出，冰冻切片包埋剂（OCT）固定，沿着组织的矢状线方向切片（LEICA CM1900），切片厚度为10 μm，冰冻切片重新保存在-80oC冰箱待用。HE染色时，首先将冰冻切片从-80oC冰箱取出，在自来水中浸泡5 min。然后在苏木素溶液中浸染5 min，自来水反蓝30 min后，伊红浸染5 min。使用梯度酒精使组织脱水，二甲苯浸泡使之透明。最后使用中性树胶封片，并正置在显微镜下观察拍片。

1.6 免疫荧光

治疗24 d后，将各组小鼠的脾脏取下，经冷冻的异戊烷浸泡后，保存在-80oC冰箱待用。切片过程同1.5，脾脏冰冻切片重新保存在-80oC冰箱待用。免疫荧光染色时，将脾脏组织切片从-80oC冰箱取出，自然风干后，在4oC丙酮中固定，经过0.1% Triton X-100透膜以及5%牛血清白蛋白BSA封闭非特异性抗原，加入PBS（Phosphate Buffered Saline）稀释的荧光一抗，置于4oC孵育过夜。避光吹干组织，加入含DAPI的防淬灭剂封片（VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI，Vector Laboratories）。封片后的组织避光保存，激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP5)观察并拍照。

1.7 流式细胞分析

治疗后24 d，眼球采血0.5 ml，加入0.9%氯化铵裂解液以裂解外周血中的红细胞，离心收集小鼠外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。PBS重悬、清洗后，加入荧光抗体在4oC避光孵育30 min，再次PBS清洗。移入流式管，在流式细胞仪（BDFACS AriaTMII）上检测并分析。

1.8 存活时间分析

治疗后3个月观察小鼠生活状态，分析各组小鼠的存活时间。

2 结果

2.1 原位肿瘤血管的损伤

血管造影显示对照组荷瘤小鼠中肿瘤血管丰富。肿瘤的边缘存在一些大的血管分支，中心区域则有众多的肿瘤新生血管丛，见图3(a)。经过温热治疗之后，肿瘤中心和肿瘤边缘的血管都显著减少，见图3(b)，肿瘤血管只存在于肿瘤基底部位和边缘区域，并且血管形态发生了明显的改变，膨胀程度增加。图3(c)显示冷热治疗后血管破坏严重，几乎不存在。表明热物理治疗能够对肿瘤血管起到较严重的破坏作用，切断对肿瘤氧气和营养物质的供给，而肿瘤冷热交替治疗比温热治疗效果更加显著。

2.2 原位肿瘤组织的损伤

HE染色结果发现无论在肿瘤的中心区域和边缘区域，相对于荷瘤对照组和温热组，冷热交替治疗造成了严重的组织坏死，其中尤与边缘区域更为明显，见图4，细胞核（蓝色）减少，坏死后出现的红色间质增多。

图3 肿瘤新生血管损伤结果Fig.3 Tumor microvasculature lesion results

图4 苏木素伊红染色肿瘤组织损伤Fig.4 Hematoxylin and eosin staining showed necrosis in tumor

2.4 外周血中免疫抑制细胞的变化

外周血是MDSCs分布的重要场所。治疗24 d后（即接种45 d），荷瘤对照组小鼠出现大量死亡，为保证有完整的对照组，观察最终冷热交替对脾脏浸润免疫抑制细胞的作用，因此选取治疗24 d分析外周血中MDSCs细胞的改变。图5是小鼠流式检测结果，MDSCs为CD11b+Gr-1+细胞，利用流式细胞术可以定量分析出其所占PBMC的比例。治疗后24 d，以正常组小鼠含量为基准，对照组小鼠外周血中MDSCs所占百分显著增加，达到28.7%。温热组与对照组相比有所下降，为19.6%，但也没有达到正常小鼠的水平。冷热交替治疗后MDSCs恢复至正常水平。

2.5 脾脏中免疫抑制细胞解除

图5 外周血中各组MDSCs的变化Fig.5 Flow cytometry detects MDSCs changing in PBMC of different groups

脾脏是小鼠重要的免疫器官，荷瘤小鼠脾脏中会浸润大量的免疫抑制细胞。治疗24 d后，利用免疫荧光检测脾脏中MDSCs细胞的改变。激光共聚焦的免疫荧光结果，见图6，发现冷热交替治疗后脾脏中MDSCs数量显著下降。与对照组相比，温热治疗后脾脏中的MDSCs也明显减少，但依然存在一定数量的免疫抑制细胞，机体的免疫抑制并没有被完全解除。

图6 激光共聚焦显微镜的免疫抑制细胞荧光图Fig.6 Confocal microscopy immuno fluorescence images of immune suppressive cells after the thermal treatments

2.6 肿瘤冷热交替可以显著提高存活率

对治疗后的小鼠治疗进行3个月的观察，每组8只小鼠。冷热交替治疗后，其中7只小鼠生活状态良好，没有发生任何体表转移。对照组小鼠在接种后50 d内全部死亡。温热治疗虽然能够延长小鼠的存活时间，但大部分小鼠在60 d内死亡，只有1只在3个月内没有发生体表转移的现象。因此，冷热交替治疗肿瘤可以极大的提高小鼠生存率，达到良好的治疗效果。

3 总结和讨论

本研究以4T1乳腺癌为模型，研究冷热交替局部肿瘤治疗后，原位肿瘤的损伤及对外周血和脾脏中免疫抑制细胞MDSCs变化及对疗效的影响，分析冷热交替治疗肿瘤的可能的机制。研究结果表明，冷热交替治疗可以造成更严重的肿瘤血管破坏以及组织坏死。更重要的是解除了外周血和脾脏中的抗肿瘤免疫抑制，最终达到很好的治疗效果。

冷热交替治疗所达到的较高的治疗效果，主要归因于以下三个方面。首先，冷热交替治疗破坏大量的肿瘤血管。肿瘤血管在肿瘤的生长、转移和复发过程中起到了重要的作用[21]，是许多肿瘤治疗中的靶点。相对于热疗，冷热交替治疗对肿瘤血管产生更严重的破坏，降低了肿瘤细胞通过血管转移到远端的风险。其次，冷热交替治疗造成更严重的组织坏死，肿瘤细胞坏死可以释放出具有促炎症功能的DAMP[22-24]以及抗原肽，通过促进肿瘤抗原的呈递、激活DC细胞的活性并促进其成熟的方式诱导抗肿瘤免疫[25]。同时，坏死组织释放的抗原肽作为危险信号使得残留的肿瘤细胞对CTL的杀伤作用更敏感[26]。 再次，冷热交替治疗可以解除外周血和脾脏中MDSCs的聚集。MDSCs（CD11b+Gr1+）的增加是肿瘤生长和转移的标志性特征[27]，可以抑制肿瘤特异性CD8+T细胞的功能，导致许多癌症的不良预后[28]。近年来，免疫抑制细胞已经成为肿瘤治疗中新的靶点[29]。外周血和脾脏中MDSCs的降低预示着局部治疗会解除机体全身的免疫抑制。

相比之下，尽管热疗也可以产生肿瘤细胞的坏死，诱导抗肿瘤免疫[30-32]。但是治疗过后，外周血和脾脏中MDSCs 的含量不能恢复至正常水平，即免疫抑制没有完全解除。说明热疗激起的抗肿瘤免疫响应不足以将残留的肿瘤细胞全部杀死，导致治疗过后肿瘤的复发和转移。另一个方面，热疗过后，肿瘤血管没有被完全破坏，增加了残留肿瘤细胞通过血管转移到远端的可能。

本研究以自主研发的冷热交替治疗仪为基础，创新性的提出了冷热交替治疗肿瘤的治疗方案。同常规的热疗相比较，冷热交替治疗可获得较高的存活率。表明冷热治疗对于转移性肿瘤具有很好的治疗效果，该效果可能是由肿瘤的局部损伤引起了机体全身的抗肿瘤免疫响应引起，是一种由局部到全身的治疗方式，更多的机制将进一步深入研究。冷热交替有可能成为将来治疗转移性肿瘤的新型热物理治疗方法。

[1]Sun J, Zhang A, Xu LX.Evaluation of alternate cooling and heating for tumor treatment[J].Int J Heat Mass Transfer, 2008, 51: 5478-5485.

[2]Siegel R, Naishadham D, Jemal A.Cancer statistics for Hispanics/Latinos[J], CA Cancer J Clin, 2012, 62(5): 283-298.

[3]Fisher B, Gunduz N, Coyle J, et al.Presence of a growthstimulating factor in serum following primary tumor removal in mice[J].Cancer Res, 1989, 49(8): 1996-2001.

[4]Lage H.An overview of cancer multidrug resistance: a still unsolved problem[J].Cell Mol Life Sci, 2008, 65(20): 3145-3167.

[5]Seymour CB, Mothersill C.Radiation induced bystander effects implications for cancer[J].Nat Rev Cancer 2004; 4(2): 158-164.

[6]Gordon MS, Mendelson DS, Kato G.Tumor angiogenesis and novel antiangiogenic strategies[J].Int J Cancer, 2009, 126(8):1777-1787.

[7]Lunt SJ, Chaudary N, Hill RP.The tumor microenvironment and metastatic disease[J].Clin Exp Metastasis, 2009, 26(1): 19-34.

[8]Kusmartsev S, Gabrilovich DI.Role of immature myeloid cells in mechanisms of immune evasion in cancer[J].Cancer Immunol Immunother, 2006, 55(3): 237-245.

[9]Schmid MC, Varner JA.Myeloid cells in the tumor microenvironment: modulation of tumor angiogenesis and tumor in flammation[J].J oncol, 2010, 2010: 201026

[10]Murdoch C, Muthana M, Coffelt SB, et al.The role of myeloid cells in the promotion of tumour angiogenesis[J].Nat Rev Cancer,2008, 8(8): 618-631.

[11]Ostrand-Rosenberg S.Myeloid-derived suppressor cells: more mechanisms for inhibiting antitumor immunity[J].Cancer Immunol Immunother, 2010, 59(10): 1593-1600.

[12]Schaefer L, Iozzo RV.Small leucine-rich proteoglycans, at the crossroad of cancer growth and in flammation[J].Curr Opin Genet Dev 2012, 22(1): 56-57.

[13]Zhang HG, Mehta K, Cohen P, et al.Hyperthermia on immune regulation: a temperature’s story[J].Cancer Lett, 2008, 271(2):191-204.

[14]Subjeck JR, Sciandra JJ, Johnson RJ.Heat shock proteins and thermotolerance; a comparison of induction kinetics[J].Br J Radiol,1982,55(656):579-584.

[15]Machlenkin A, Goldberger O, Tirosh B, et al.Combined dendritic cell cryotherapy of tumor induces systemic antimetastatic immunity[J].Clin Cancer Res, 2005, 11(13): 4955-4961.

[16]Shen Y, Liu P, Zhang A, et al.Study on tumor microvasculature damage induced by alternate cooling and heating[J].Ann Biomed Eng, 2008, 36(8): 1409-1419.

[17]Tao K, Fang M, Alroy J, et al.Imagable 4T1 model for the study of late stage breast cancer[J].BMC cancer, 2008, 8(1):228.

[18]董佳祥.冷热交替热物理治疗引起小鼠乳腺癌抗肿瘤免疫响应研究[D]上海交通大学, 2008.

[19]Dong J, Liu P, Xu LX.Immunologic response induced by synergistic effect of alternating cooling and heating of breast cancer[J].Int J Hyperthermia, 2009, 25(1):25-33.

[20]Cai Z, Song M, Sun J, et al.Design of a new probe for tumor treatment in the alternate thermal system based on numerical simulation[A].Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc[C], 2011:6874-6877.

[21]Folkman J.The role of angiogenesis in tumor growth[J].Semin Cancer Biol, 1992, 3(2): 65-71.

[22]Koberne M, Beignon AS, Bhardwaj N.Danger signals: a time and space continuum[J].Trends Mol Med, 2004,10:251-257.

[23]Huang XF, Ren W, Rollins L, et al.A broadly applicable,personalized heat shock protein-mediated oncolytic tumor vaccine[L].Cancer Res, 2003, 63: 7321.

[24]Yang D, Chen Q, Yang H, et al.High mobility group box-1 protein induces the migration and activation of human dendritic cells and acts as an alarmin[J].J Leukoc Biol, 2007, 81: 59-66.

[25]Zou W.Immunosuppressive networks in the tumour environment and their therapeutic relevance[J].Nat Rev Cancer, 2005, 5:263-274.

[26]Liu Q, Zhai B, Yang W, et al.Abrogation of local cancer recurrence after radiofrequency ablation by dendritic cell-based hyperthermic tumor vaccine[J].Mol Ther, 2009, 17: 2049-2057.

[27]Talmadge JE.Immune cell infiltration of primary and metastatic lesions: mechanisms and clinical impact[J]. Semin Cancer Biol,2011, 21(2): 131-138.

[28]Nagaraj S, Schrum AG, Cho HI, et al.Mechanism of T cell tolerance induced by myeloid-derived suppressor cells[J].J Immunol 2010, 184:3106-3116.

[29]Bianchi G, Borgonovo G, Pistoia V, et al.Immunosuppressive cells and tumour microenvironment: focus on mesenchymal stem cells and myeloid derived suppressor cells[J].Histol Histopathol, 2011,26: 941.

[30]Bendz H, Ruhland SC, Pandya MJ, et al.Human heat shock protein 70 enhances tumor antigen presentation through complex formation and intracellular antigen delivery without innate immune signaling[J].J Biol Chem 2007, 282: 31688-31702.

[31]Binder RJ, Blachere NE, Srivastava PK.Heat shock proteinchaperoned peptides but not free peptides introduced into the cytosol are presented efficiently by major histocompatibility complex I molecules[J].J Biol Chem, 2001, 276: 17163-17171.

[32]Schueller G, Kettenbach J, Sedivy R, et al.Heat shock protein expression induced by percutaneous radiofrequency ablation of hepatocellular carcinoma in vivo[J].Int J Oncol 2004, 24: 609-613.