衣霉素诱导胃癌细胞内质网应激介导上皮间质转化的发生

甘惠中，史冠男，戴 夫，彭 琼

安徽医科大学第三附属医院消化内科，安徽合肥230061

上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transtions，EMT)是上皮细胞来源肿瘤发生局部浸润和远处转移的一个重要途径［1］。细胞遗传学及临床研究发现胃癌中EMT相关基因存在高表达，提示EMT参与胃癌的侵袭与转移［2-3］。已有大量研究显示，内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)可诱导包括肝癌细胞、乳腺癌细胞等多种肿瘤细胞发生EMT［4］;但胃癌细胞中未见研究报道。本研究旨在观察TM诱导的ERS能否介导胃癌SGC-7901细胞发生EMT，以期为寻找抑制胃癌侵袭、转移新靶点提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞系 胃癌细胞SGC-7901由安徽医科大学第三附属医院消化内科保存。

1.2 主要仪器和试剂 本研究采用美国Bio-Rad公司电泳仪、电泳槽和转移电泳槽;美国Thermo公司酶标仪;日本三洋公司二氧化碳孵箱;北京半导体设备厂JTT-7A超净工作台;Eppendorf公司台式高速冷冻离心机;RPMI 1640培养基购自美国Hyclone公司;胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司;葡萄糖调节蛋白 78(glucose-regulated protein78，GRP78)、E-钙黏蛋白(E-cadherin，E-cad)、N-钙黏蛋白(N-cadherin，N-cad)一抗购自 Bioworld公司;甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗及二抗购自北京中杉金桥生物技术公司。TM购自美国Sigma公司，使用时用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)配制，再用培养液配成10 μg/ml浓度备用。0.25%胰酶、PBS由本实验室自行配置。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养及分组:复苏SGC-7901细胞，按1×105个/孔的密度接种于6孔板中，每孔2 ml。使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，置37℃、5%CO2培养箱内培养。待细胞进入指数生长期后，将其分为TM组、阴性对照组与DMSO组，每组2个复孔。TM组加入10 μg/ml的TM;阴性对照组仅加含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液;DMSO组加入与TM组相同体积的DMSO，置37℃、5%CO2培养箱内培养规定时间后收取细胞用于检测。

1.3.2 RT-PCR 检测 GRP78、E-cadherin、N-cadherind mRNA表达:10 μg/ml TM处理胃癌SGC-7901细胞0、6、12、24 h，RT-PCR 法检测 GRP78 mRNA 的表达，取GRP78高表达时间点作为本研究诱导时间，提取总RNA，同时检测 E-cadherin、N-cadherin表达。参照GenBank 中 GRP78、E-cadherin、N-cadherin、GAPDH 序列引物设计(见表1)。PCR扩增反应条件为:95℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸60 s，最后72℃总延伸10 min，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

表1 PCR引物序列Tab1 PCR primer sequences

1.3.3 Western blotting 检测 GRP78、E-cadherin、N-cadherin的蛋白表达:10 μg/ml TM 处理胃癌 SGC-7901 细胞 0 、6、12、24 h，Western blotting 检测 G RP78蛋白表达，取GRP78高表达时间点作为本研究诱导时间，提取总蛋白，制备蛋白样品后，同时灌胶、上样、跑SDS-PAGE电泳，检测E-cadherin及N-cadherin蛋白表达;转膜后将膜泡在10%的牛奶里室温封闭1 h。孵育一抗，杂交袋封闭，4℃过夜。用TBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次10 min。同上方法准备二抗稀释液，室温下孵育1 h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗5次，每次10 min，化学发光、显影、定影。

1.3.4 细胞形态学观察:10 μg/ml TM处理12 h后，冰浴PBS洗涤细胞，用光学显微镜观察细胞的形态变化情况并拍照。

1.3.5 细胞划痕试验检测SGC-7901细胞TM诱导前后侵袭转移能力:在6孔板每孔加入约5×105个细胞，过夜。阴性对照组、TM组、DMSO组分别处理12 h后，用10 μl枪头垂直划痕，PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，置37℃的5%CO2培养箱内继续培养。按0、12、24 h取样、拍照。

1.4 统计学处理 采 用SPSS 13.0软件进行分析，计量资料结果采用±s表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT－PCR法检测结果

2.1.1 RT-PCR检测SGC-7901细胞经10 μg/ml TM处理 0、6、12、24 h GRP78 mRNA 表达:GRP78 mRNA于10 μg/ml TM处理6 h后开始上升，12 h达到顶峰，24 h内维持在一定高水平，与0 h比较差异有统计学意义(P＜0.05，见图1)。因此，本研究采用10 μg/ml TM处理SGC-7901细胞12 h为诱导方法。

图1 10 μg/ml TM处理不同时间GRP78 mRNA表达Fig 1 Expression of GRP78 mRNA in different time with 10 μg/ml TM treatment

2.1.2 10 μg/ml TM 处理12 h前后 SGC-7901细胞ERS及EMT相关指标mRNA水平变化:10 μg/ml TM处理12 h后，可见胃癌细胞中GRP78 mRNA明显高表达，差异有统计学意义(P＜0.05)，与此同时，TM组E-cad mRNA的表达较阴性对照组下降;TM组N-cad mRNA的表达较阴性对照组明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05，见图2)。

2.2 Western blotting法检测结果

2.2.1 检测SGC-7901细胞经10 μg/ml TM处理0、6、12、24 h GRP78 蛋白表达:GRP78 蛋白于 10 μg/ml TM处理6 h后开始上升，12 h达到顶峰，24 h内维持在一定高水平，与0 h比较差异有统计学意义(P＜0.05，见图3)。因此，本研究采用10 μg/ml TM 处理SGC-7901细胞12 h为诱导方法。

2.2.2 TM处理前后ERS及EMT相关指标蛋白水平变化:予以 10 μg/ml TM 处理 12 h后，胃癌细胞GRP78蛋白表达明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，与此同时，TM组E-cad蛋白表达较阴性对照组下降;TM组N-cad蛋白表达较阴性对照组明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05，见图4)。

图4 ERS及EMT相关指标蛋白表达图 1:阴性对照组;2:TM组Fig 4 Protein expression of ERS and EMT－related indicators 1:Negative control group;2:TM group

2.3 10 μg/ml TM处理的ERS对SGC－7901细胞形态学变化的影响 光镜下观察细胞形态，阴性对照组SGC-7901细胞贴壁后胞体呈圆形或椭圆形;10 μg/ml TM处理12 h的SGC-7901细胞，可见胞体呈梭状并有伪足生成(见图5)。

图5 10 μg/ml TM处理12 h前后SGC－7901细胞形态学变化 (200×)A:阴性对照组的正常SGC-7901;B:10 μg/ml TM处理12 h后的SGC-7901，箭头所指方向为伪足形成Fig 5 Morphological changes of SGC－7901 cells before and after treatment with 10 μg/ml TM for 12 h(200 × )

2.4 TM诱导ERS前后侵袭转移能力比较 TM诱导ERS后，阴性对照组12 h细胞划痕愈合率为(39.867±3.528)%，24 h细胞划痕愈合率为(80.200±2.300)%;TM组12 h细胞划痕愈合率为(56.333±4.430)%，24 h细胞划痕愈合率为(96.800±0.954)%;DMSO组12 h细胞划痕愈合率为(41.633±1.069)%，24 h细胞划痕愈合率为(79.333±3.044)%。TM组比阴性对照组细胞划痕愈合速度快，划痕缩窄明显，差异有统计学意义(P＜0.05);DMSO组与阴性对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05，见图 6)。

图6 细胞划痕图(200×)A:阴性对照组;B:TM组;C:DMSO组Fig 6 Cell scratch map(200×) A:Negative control group;B:TM group;C:DMSO group

3 讨论

研究表明，由于低糖、低氧、低钙等慢性应激反应的刺激，大多数肿瘤细胞中普遍存在ERS激活现象，表现为GRP78蛋白与未折叠蛋白反应(unfold protein response，UPR)3条通路相关的PERK、IRE-1及 ATF6等跨膜蛋白结合的分离，从而激活UPR，可见GRP78蛋白在内质网应激反应中发挥重要作用［5］。本研究以浓度为10 μg/ml的TM处理胃癌SGC-7901细胞12 h，GRP78表达达高峰，24 h维持较高水平，说明成功诱导胃癌SGC-7901细胞发生了ERS。

EMT的发生是一个多基因、多步骤、多阶段的复杂过程，发生EMT后，上皮细胞失去了细胞极性，细胞间黏附力下降，并逐渐生成伪足，获得了较高的迁移、侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质等间质细胞表型的能力。目前研究表明，EMT在多种恶性肿瘤的原发性浸润和远处转移中发挥重要作用，如胰腺癌［6］、肝癌［7］、胃癌［8］等。肿瘤细胞中存在的ERS激活及UPR已被证实与肿瘤细胞的生存、演进、耐药性甚至转移有关，但其确切机制尚未明确。近年来越来越多的证据证实，肿瘤微环境触发肿瘤细胞发生ERS可介导其发生EMT。Bambang等［9］证实乳腺癌 MDA-MB-231 细胞中，ERP29的过表达使细胞表型发生EMT，使肿瘤细胞失去侵袭和转移性质。Tai等［7］发现敲除存活素基因的Hep3B肝癌细胞中GRP78的表达下调而EMT标志的波形蛋白的表达上调，进而介导其发生EMT。Ulianich等［10］报道称在甲状腺PC Cl3细胞中ERS可介导其发生EMT现象。因此，肿瘤细胞内普遍存在的ERS可诱导其发生 EMT。本研究发现，在10 μg/ml TM作用于胃癌SGC-7901细胞12 h GRP78高表达时，TM组E-cad较阴性对照组表达下调，N-cad较阴性对照组表达上调;光镜下观察细胞形态，发现TMSGC-7901组细胞胞体呈梭状并有伪足生成;划痕试验结果示，TM组比阴性对照组细胞生长速度快，愈合早，说明胃癌细胞发生了EMT，同时其侵袭、转移能力增强。因此本研究认为TM诱导的ERS可介导胃癌SGC-7901细胞发生 EMT，进而促进该肿瘤细胞的侵袭、转移。

本研究只是对胃癌SGC-7901细胞中ERS与EMT的关系初步探讨，由于实体肿瘤微环境复杂，ERS诱发因素及下游信号通路较多，ERS与肿瘤细胞生存、肿瘤血管生成及肿瘤细胞凋亡等均有关，因此，胃癌中ERS与EMT确切关系有待进一步更深入研究。

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