凤尾草不同溶媒提取功能成分的抗菌效果比较

刘湘红，刘远超，韩晓萍，王小莺

(江西农业大学动物科技学院，江西南昌330045)

凤尾草（Pteris multifida Poir） 属于凤尾蕨科、凤尾蕨属，别名鸡爪草、井栏草、小叶凤尾草，多年生草本，生长于半阴湿的岩石及墙角石隙中。凤尾蕨全草都可供药用，主要成分含黄酮类、多元酸以及对映贝壳杉烷型二萜[1]等生理活性物质，具有清热利湿、抗菌消炎、消肿止痛等功效，多用于治痢疾和止泻[2]。民间及临床用全草治疗痢疾、外伤出血、烫伤、烧伤以及扁桃体炎、肝炎等，其根茎还可用于治疗糖尿病、抗肿瘤[2]。目前，凤尾草的抗菌作用虽有文献记载，但国内外相关报道还是较少。凤尾草功能成分提取近年来逐步有些报道，但多数用水和乙醇提取[1,3]。此外，还有研究用甲醇法[4]、碱液法[5]、色谱分离等提取功能成分。

本研究以凤尾草为原料,以乙醇和丙酮为溶剂提取及蒸馏水煎煮，比较提取的功能成分抗菌效果，旨在探索较好的提取方法，为凤尾草药效的开发和利用提供新思路。

1 材料

1.1 药材

凤尾草：全草于2011年6月15日采集于江西农业大学校园内，清洗干燥粉碎后备用。

1.2 试验菌株

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、沙门氏菌(Salmonella)和嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、大肠杆菌(Escherichia coli)，由江西农业大学动物科学技术学院预防兽医教研室分离鉴定并保存。

1.3 培养基

普通肉汤培养基，肉汤琼脂培养基用于细菌培养。

2 方法

2.1 凤尾草提取液制备

2.1.1 凤尾草醇提液的制备 取凤尾草全草洗净，60℃干燥，粉碎过40目筛，精密称取粗粉5g，装于滤纸包内，置于索氏提取器中，用体积分数60%的乙醇热回流提取1 h，温度控制在60℃[3]，料液比1：20的相同条件下浸提3次，每次浸提1h，过滤合并提取液，用旋转蒸发仪减压蒸发浓缩(温度控制在60℃)，即得凤尾草乙醇提取液，浓度为0.7g生药/ml。

2.1.2 凤尾草丙酮提取液的制备按上述方法用60%的丙酮替代60%的乙醇热回流提取浓缩，即获得凤尾草的丙酮提取液，浓度为0.943g生药/ml。

2.1.3 凤尾草水煎液的制备精密称取凤尾草干燥粉末5g，加蒸馏水浸泡20min后，以料水比1:30，水煎3次，每次1h，过滤，合并水煎液，用旋转蒸发仪在60℃下蒸发浓缩获得浓度为0.442 g生药/ml的凤尾草水煎液。

将以上三份提取液分别用细菌过滤器过滤后将滤液置于4℃冰箱保存备用，使用期限为一周。

2.2 受试菌菌液的制备

将金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌、嗜水气单胞菌、大肠杆菌的新鲜培养物接种于普通琼脂培养基，置于37℃生化培养箱中培养16~18h，次日挑选单个菌落1～2个接种于2ml普通肉汤培养基中，置于37℃恒温箱16～18h培养后取出。用平皿法测定细菌浓度。临用前将菌液用肉汤培养基稀释成菌液浓度为105CFU/ml，备用。

2.3 MIC值测定

按试管二倍稀释法测定MIC值。取灭菌小试管30支，每10支一组分别排列试管架上，并将每组试管按照1至10编号，每种菌都三次重复。放置37℃生化培养箱中培养18~24h后取出观察细菌生长状况。以能抑制细菌生长的最小浓度为提取液对该细菌的最低抑菌浓度（MIC）。

3 结果与分析

本实验所选用水煎煮和用乙醇、丙酮回流提取所得的提取液，对临床分离的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌、嗜水气单胞菌、大肠杆菌的体外抑菌结果的MIC见表1。

表1 凤尾草提取液最低抑菌浓度结果（mg生药/ml）

由表1可知，三种提取液对革兰氏阴性、阳性菌均有抑制作用，但抑制效果不同。丙酮提取液的抑菌活性最强，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及嗜水气单胞菌的MIC均为29.48（mg生药/ml）。其次为乙醇提取液，水煎液效果最差。由此可知，用乙醇和丙酮热回流提取比传统的水煎法提取凤尾草的功能成分抗菌效果更好。

4 讨论

水煎液效果差的原因可能与煎煮汤剂所用水量的多少、火候的大小及时间的长短等有关，这些因素会直接影响药物有效成分溶出，也可能煎煮对功能成分的破坏有关，因为传统的煎煮法温度达到100℃。刘国凌报道，温度对凤尾草水溶性黄酮的浸提有显著的提高，但温度超过90℃以后，得率稍有下降，可能会导致部分黄酮类物质的分解而使总黄酮得率下降[6]。吴英华报道，在提取因子中，温度对凤尾草总黄酮提取率影响最大。在试验条件下，随温度的升高，凤尾草总黄酮提取率逐渐增大，但当温度达到60℃以后，温度再升高，总黄酮的提取率反而下降[3]。

不同方法提取的功能成分会有所不同，可能会对抗菌效果产生影响。近年来，随着凤尾草的深入研究,分离提取得到更多的活性成分。据报道，刘清飞首次从凤尾草根茎中分离提取到多个化合物，鉴定出其中4个。除β谷甾醇外，其他3个为四环二萜贝壳杉烷(烯)类化合物，均为首次从凤尾草根茎中分离到[1]。秦波等人从凤尾草的丙酮和20%乙醇提取物中，分离得出一个倍半萜苷和6个黄酮类化合物，其中有4种黄酮类化合物为首次分离得到[7]。

中药提取物本身有颜色，对MIC测定的实验结果的判断有一定影响。提取方法获得的药物是否通过旋转蒸发仪将有机溶剂去除的干净，可能影响实验结果。

[1]刘清飞,秦明珠.凤尾草根茎的化学成分研究.中草药[J],2002,33(2):1132-1141.

[2]杨春澎.药用植物学.[M].1997,上海:上海科学技术出版社.

[3]吴英华,蔡小华,任凤莲.凤尾草中总黄酮的提取工艺研究.光谱实验室[J],2008,25(2):195-198.

[4]王文蜀,王志骞,周亚伟.凤尾草化学成分研究.中药材[J].2008,31(8)：1165-1167.

[5]余有贵,赵良忠,段林东.凤尾草功能成分提取与抗菌效果研究.中国饲料[J].2004(023):23-24.

[6]刘国凌,宁正祥,彭小红.凤尾草黄酮类化合物的水提工艺条件研究.食品科学[J].2008,29(8):286-288

[7]QINBo.ZHUDa-Yuan,JIANGShan–Hao,et al,Chemical Constituents of Pterismultifida and Their Inhibito2ry Effectson Growth of Rat Pr ostatic Ep ithelial Cells in vitro[J].Chinese Journal of NaturalMedicines,2006,4(6):431.