日本血吸虫可溶性虫卵抗原诱导B10细胞产生的研究

田 芳，胡雪莉，杨维平，钱 莉，魏 慧，刘 浩，潘兴元，季明春

根据B细胞分泌的细胞因子不同，可以将B细胞分为效应性B细胞亚群和调节性B细胞亚群［1］。调节性B细胞能够分泌IL－10或TGFβ－1，分别称为B10细胞和Br3细胞［2－4］。调节性B细胞在自身免疫病、慢性炎症、肿瘤及寄生虫感染等疾病中发挥着重要的作用［5－6］。近年来研究提示曼氏血吸虫感染可以诱导能够产生IL－10的调节性B细胞产生，这些细胞能阻止过敏性炎症反应［7－9］。日本血吸虫可溶性虫卵抗原（SEA）和成虫抗原（SWAP）是血吸虫感染过程中最主要的两种抗原成分［10］，但是关于SEA和SWAP是否能够诱导调节性B细胞产生尚未见报道。本研究通过体外体内两种途径，探讨了SEA和SWAP是否能诱导调节性B细胞产生，为进一步探讨SEA在诱导免疫反应中的作用，及其诱导机体特异性免疫应答下调的机制提供了参考依据。

1 材料方法

1.1 实验动物 C57BL/6J小鼠，6～8周龄，雌性，购自扬州大学实验动物研究中心。

1.2 抗原制备 日本血吸虫成虫或虫卵适量，在冰上用组织匀浆器匀浆20 min，－70℃冻存后，取出室温（22℃）融化，反复4～5次后再置4℃冷浸24 h（中间拿出摇匀），4℃，10 000 r/min离心20 min，用0.22μm滤器（Millipore Co.，USA）过滤上清，－20℃冻存，制成可溶性成虫抗原（SWAP）和可溶性虫卵抗原（SEA）。

二辛可宁酸（Bicinchoninic acid，BCA）蛋白检测试剂盒（Pierce Biotechnology，Inc.，IL，USA）检测抗原浓度。LPS购自sigma公司。

1.3 体外实验

1.3.1 体外刺激小鼠脾细胞和脾脏B细胞 正常小鼠剖杀后无菌取脾脏，制备脾脏单个核细胞或用CD19＋磁珠（Miltenyi）分选CD19＋B细胞，均用完全RPMI 1640调整细胞为2×106/m L，每孔1 m L细胞悬液于24孔培养板中，分别用SEA（20μg/m L）、SWAP（10μg/m L）和LPS（10μg/m L）刺激共培养，并设空白对照，置于37℃、5%CO2孵箱中培养，72 h后收集细胞和上清。

1.3.2 调节性B细胞分泌IL－10水平的检测 用小鼠ELISA试剂盒（达科为公司）检测不同抗原刺激后细胞培养上清中IL－10水平，按照试剂盒操作说明书进行。将不同稀释度的标准品以及待测样本加入反应孔，每个样品作双复孔。根据不同浓度下标准品的吸光度值绘制标准曲线，再根据待测培养上清的吸光度值换算细胞因子的浓度。

1.3.3 细胞内因子IL－10的检测 检测细胞内因子IL－10水平，取抗原刺激后的B细胞，加入PMA（1μg/m L）和ionomycin（50μg/m L）37 ℃，5%CO2细胞培养箱中培养1 h，每100μL反应体系加入BFA 2μL，37℃，5%CO2细胞培养箱中培养5 h。收集培养细胞，经Cytofix/cytoperm（BD公司）固定通透细胞后，加入PE标记的抗小鼠IL－10（eBscience公司），阴性对照管加PE标记的同型对照抗体，4℃避光孵育30 min，洗涤后重悬于500 μL PBS中，经流式细胞仪（FACS，Calibur）检测。

1.3.4 细胞表面协同刺激分子的检测 收集体外刺激后的小鼠B细胞，加入PE标记的抗小鼠CD80、CD86和 CD40（eBscience公司），设空白对照，4℃避光孵育30 min，洗涤后重悬于500μL PBS中，经FACS检测。

1.4 体内实验

1.4.1 SEA和SWAP致敏小鼠模型建立 SEA（50μg）、SWAP（50μg）和PBS分别于不完全弗氏佐剂（IFA，sigma）1∶1等体积混合，腹股沟皮下单点免疫，每组6只小鼠，每只小鼠0.1 m L/次，隔1周免疫1次，共免疫3次，于末次免疫后2周剖杀小鼠。无菌取脾脏，制备单个核细胞，一部分细胞用于流式分析胞内因子，另一部分细胞磁珠分选B细胞，同体外实验相同SEA、SWAP、LPS分别刺激，置于37℃、5%CO2孵箱中培养，72 h后收集细胞培养上清。

1.4.2 调节性B细胞分泌IL－10水平的检测 取B细胞培养上清，按步骤1.3.2用ELISA试剂盒检测B细胞分泌细胞因子IL－10水平。

1.4.3 细胞内因子IL－10的检测 检测细胞内因子IL－10水平，取脾脏单个核细胞，加入PMA（1 μg/m L）和ionomycin（50μg/m L）37℃，5%CO2细胞培养箱中培养1 h，每100μL反应体系加入BFA 2μL，37℃，5%CO2细胞培养箱中培养5 h。收集培养细胞，加入 APC标记的抗小鼠CD19（eB－science公司），4℃避光孵育30 min，洗涤细胞，加入Cytofix/cytoperm固定通透细胞后，加入PE标记的抗小鼠IL－10，阴性对照管加PE标记的同型对照抗体，4℃避光孵育30 min，洗涤后重悬于500 μL PBS中，经FACS检测。

1.5 统计分析 所有数据用SPSS13.0进行统计分析，计量资料用均值±标准误（SEM）表示。用单因素方差分析（One－way ANOVA）比较各组之间的差异，P＜0.05认为有统计学差异。

2 结 果

2.1 体外诱导小鼠脾脏单个核细胞分化为B10细胞的情况 SEA体外刺激小鼠脾脏单个核细胞，SEA和LPS刺激组CD19＋IL－10＋B细胞的比例显著高于SWAP刺激组和空白对照组（P＜0.01）（图1）。

图1 SEA、SWAP和LPS体外刺激小鼠脾脏单个核细胞分化为CD19＋IL－10＋B细胞的比例Fig.1 The CD19＋IL－10＋ B cells ratio in mouse spleen mononuclear cells stimulated by SEA，SWAP and LPS

2.2 体外诱导小鼠脾脏B细胞分泌IL－10的水平

体外分选脾脏B细胞，用不同抗原刺激，结果发现（图2），SEA和LPS体外能够刺激脾脏B细胞分泌IL－10，显著高于SWAP刺激组和空白对照组（P＜0.01）。

2.3 体外诱导小鼠脾脏B细胞分化为B10细胞的情况 SEA、SWAP和LPS体外刺激小鼠脾脏B细胞，SEA刺激组IL－10＋B细胞的比例显著高于SWAP刺激组和空白对照组（P＜0.01），而与LPS

刺激组无显著性差异（图3）。

2.4 体外对小鼠脾脏B细胞活化的影响 结果显示，SEA和LPS体外刺激小鼠脾脏B细胞可以诱导B细胞表达细胞活化性受体CD80、CD86和CD40，而SWAP 不能诱导其活化（P＜0.01）（图4）。

图2 SEA、SWAP和LPS体外刺激小鼠脾脏CD19＋B细胞培养上清中IL－10水平Fig.2 Cytokines IL－10 levers in mouse spleen CD19＋B cells cultured supernatants stimulated by SEA，SWAP and LPS（n＝6；＊P＜0.05；＊＊P＜0.01）

图3 SEA、SWAP和LPS体外刺激小鼠脾脏CD19＋B细胞分化为IL－10＋B细胞的比例Fig.3 IL－10＋ B cells ratio in mouse spleen CD19＋B cells stimulated by SEA，SWAP and LPS

2.5 体内诱导小鼠脾脏B细胞分泌IL－10的水平结果发现（图5），SEA能够诱导脾脏B细胞分泌IL－10，显著高于SWAP和PBS免疫组（P＜0.05）。表明SEA体内可以刺激小鼠脾脏B细胞分泌IL－10。

2.6 体内诱导小鼠B10细胞产生的情况 结果发现，SEA免疫组能够显著诱导CD19＋IL－10＋B细胞产生比例显著高于SWAP和PBS免疫组（P＜0.01）。表明SEA 体内能够诱导小鼠 CD19＋IL－10＋B细胞产生（图6）。

3 讨 论

血吸虫病是一种典型的慢性感染性、免疫性疾病，在血吸虫感染过程的不同时期机体免疫系统针用的细胞，其起源以及确切的分化途径还不十分清楚。调节性B细胞发挥抑制功能可以通过分泌对血吸虫各发育阶段的不同抗原产生不同的优势应答。目前认为，在血吸虫感染过程中，首先宿主体内以Th1型细胞免疫应答为主，当虫体继续发育并且产生虫卵后，Th2型细胞免疫应答出现并逐渐增强。Th1型免疫反应尤其是IFN－γ与宿主抗血吸虫感染的保护性免疫力相关，而Th2型免疫反应虽然能够诱导虫卵肉芽肿，抑制虫卵对肝脏的损害，但不利于机体对虫体的清除［10－11］。这种Th1向Th2免疫反应的极化除了与虫体抗原种类有关外，宿主的免疫系统也发挥着重要的免疫负调控作用。其中CD4＋CD25＋Foxp3＋T细胞（Treg）在血吸虫感染过程中就发挥着重要的负向调节作用［12－13］。

图4 SEA、SWAP和LPS体外刺激小鼠脾脏CD19＋B细胞表面CD80、CD86和CD40的表达水平Fig.4 Expression of CD80，CD86 and CD40 on mouse spleen CD19＋B cells stimulated by SEA，SWAP and LPS

图6 SEA、SWAP和PBS体内免疫小鼠后脾脏CD19＋IL－10＋B细胞的比例Fig.6 The CD19＋IL－10＋ B cells ratio in mouse spleen mononuclear cells immunized by SEA，SWAP and PBS

调节性B细胞也是一群重要的发挥负向调节作IL－10或TGF－β调控 Th1/Th2平衡，抑制炎症的进展或促进炎症疾病模型的痊愈，还可以通过MHC分子和B7分子调控和诱导 Treg的产生［14－16］。有研究表明在曼氏血吸虫感染小鼠后，脾脏中产生IL－10的CD1dhigh调节性B细胞产生，这群B10细胞可以通过分泌IL－10和Treg抑制气道过敏性炎症反应［7－9］。血吸虫感染后，在宿主体内有两类重要抗原即成虫抗原（SWAP）和虫卵抗原（SEA），是研究血吸虫疾病模型的工具抗原，而且SWAP和SEA两种抗原本身即可用来建立特定的免疫实验模型并已被广泛应用。但目前仍不清楚是否这两种抗原都能够诱导调节性B细胞产生，及诱导产生调节性B细胞的机制如何。

实验结果表明，SEA在体外可以诱导小鼠脾脏单个核细胞分化为B10细胞，而SWAP不能发挥作用。我们进一步体外分选了脾脏CD19＋B淋巴细胞进行抗原刺激，排除了脾脏单个核细胞中其他免疫细胞的影响，结果表明，SEA能够活化脾脏B细胞，并且能刺激脾脏B细胞分化为B10细胞，分泌IL－10，而SWAP没有同样的作用。体内实验同样表明SEA免疫后可以诱导小鼠脾脏单个核细胞分化为B10细胞。因此我们认为，SEA是主要诱导调节性B细胞（B10）产生的主要抗原。也有研究也表明，曼氏血吸虫感染小鼠后，主要是在感染的慢性期才能诱导分泌IL－10的B细胞产生，并且发挥抵抗过敏性气道炎症的作用［17］。因此，可能在感染的慢性期，虫卵产生后由SEA发挥了诱导B10细胞产生的作用。

本研究表明，日本血吸虫虫卵抗原在体内体外均能诱导调节性B细胞（B10）产生，并且在体外诱导B10细胞时不依赖于其他免疫细胞的存在。而这群B10细胞的活化机制和对Th1、Th2、Treg细胞的作用如何是需要我们进一步研究的内容。通过我们的研究，为建立以SEA抗原为工具的免疫研究模型、并且在自身免疫性疾病领域中的广泛应用提供了理论依据，为血吸虫病候选疫苗分子的筛选提供了免疫学依据。

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