几种环境污染物质在体检人群中的内暴露水平

雷雅静，朱银焕，施卫星，那仁满都拉，陈枢青

(1.浙江大学药学院药理毒理与生化药学研究所，浙江 杭州 310058;2.杭州爱贝亚检测技术有限公司，浙江 杭州 310051;3.浙江大学医学院公共卫生系，浙江 杭州 310058)

科技的发展，工业的进步在给人们的生活带来极大便利的同时，也带来前所未有的环境污染，严重影响、威胁着国民的健康水平和生命质量。多项研究表明，近些年来我国多种严重疾病的发生率、癌症死亡率持续上升，而环境污染是引起这些现象的重要原因之一。空气、水和食物等环境介质中的污染物含量被称为外暴露水平，而个体生物样本如血液、尿液等中的污染物含量被称为内暴露水平，或者称为“体内负荷”。由于个体之间具有不同的生活方式和遗传因素，造成在同样的环境下，体内可以有不同剂量的污染物，造成的健康危害风险也存在差异，因此对环境污染物进行内暴露水平的检测具有更重要的意义［1］。

为了研究 TMT、CPZ、PCBs、DBP、4，5-DCC、甲醛、甲苯、磷酸二甲酯(DMP)、磷酸二乙酯(DEP)、硫代磷酸二乙酯(DETP)、二硫代磷酸二乙酯(DEDTP)、AFM1等环境污染物的内暴露水平，本研究通过GC-MS、HPLC和ELISA等方法对多种环境污染物的人体内暴露水平进行测定，直接显示个体的环境污染物的水平，为研究内暴露水平及其对人体健康的影响奠定基础。

1 实验材料

1.1 实验试剂 标准品三甲基氯化锡和盐酸氯丙嗪、邻苯二甲酸二丁酯购于美国SIGMA，二恶英代谢物购于德国DR公司，磷酸二甲酯购于比利时ACROS公司，磷酸二乙酯、硫代磷酸二乙酯、二硫代磷酸二乙酯购于美国ALDRICH公司，磷酸二丁酯、黄曲霉毒素、甲醛、甲苯、多氯联苯购于美国FLUKA;衍生化试剂五氟溴苄苯(PFBBr)、N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTFA)、五氟丙酸酐(PFPA)购于美国FLUKA;内标:二苯胺、苯甲酮、纳多络尔(NAL)购于美国SIGMA。检测样品随机收集于医院体检时的正常人尿样。样本取回后离心取上清，保存于－20℃。

1.2 主要仪器设备 Agilent 6890GC/5975MS联用仪，配有 EI源和自动进样器;Agilent 6890N气相色谱仪，配自动进样器，FID、NPD检测器;Agilent G1888A顶空进样仪，HP ChemStations软件;Agilent1100高效液相色谱仪，G1354四元泵，柱温箱，自动进样器，Agilent化学工作站，紫外、荧光检测器;Supelco 12孔SPE固相萃取仪，杭州德佳科学仪器有限公司;电子天平 AL104，上海第二天平厂;Anke TDL80-2B离心机 ，美国BECKMAN公司;WH-861蜗旋仪，江苏泰昌;吹干仪，DHG-9123A干燥箱，DK-8D型恒温水浴锅，上海精宏。

1.3 样本收集 于2009年9月，在受检者知情同意的情况下，本实验组收集了浙江省台州市80例体检者的晨尿或停止饮水2 h后的随机尿。受检者年龄在18～65岁之间，为非职业性、非事故性接触所测污染物质的样本。所有尿样离心后取上清保存于－20℃备用。

2 实验方法

2.1 GC法检测尿样中几种环境污染物的含量

2.1.1 GC/MS法检测尿样中三甲基氯化锡、盐酸氯丙嗪的含量 样品预处理:吸取尿样10 ml于萃取瓶中，加氯化钠3 g，5%NaOH 200 μl，调节pH 约8.5，再加入乙酸乙酯10 ml进行萃取，1500 r/min蜗旋5 min后，3000 r/min离心4 min，吸出有机相，加入5 g无水硫酸钠除水，常温常压下用氮气浓缩，定容至500 μl进样分析，进样量1 μl。色谱条件:色谱柱为DB-5MS(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm)毛细管色谱柱，进样口温度:280℃;程序升温:初始温度60℃，保持2 min，以10℃/min升至80℃，然后40℃/min升至270℃，再5℃/min至280℃，保持5 min。以10/1分流比进样，进样体积1 μl;载气为高纯氦气，流速1.0 ml/min;EI离子源，离子源温度230℃;四级杆温度150℃;辅助通道温度290℃;选择离子监测模式(SIM);TMT的定性离子为 165、183、185、187、200;CPZ 的定性离子为 58、86、233、272、318。TMT 的定量离子为185;CPZ的定量离子为318。

2.1.2 GC/MS法检测尿样中多氯联苯的含量本研究参照Hong等人［2］报道的有关 PCBs的检测，氯联苯主要代谢物为:2-羟基-2'，5，5'-三氯联苯(2-OH-TrCB);4-羟基-2'，3，5，5'-四氯联苯(4-OH-TeCB)和 4-羟基-2'，3，3'，4'，5'-五氯联苯(4-OH-PeCB)。

2.1.3 GC/MS法检测尿样中 DBP的含量参照有关DBP气质联用的检测报道［3］，本研究确定了尿样中DBP的检测方法。

2.1.4 顶空气相色谱法检测尿液中甲醛、甲苯含量 甲酸为甲醛在人体内的主要代谢产物。近年已有报道采用顶空气相法单独对甲醛代谢物［4］和甲苯［5］进行了检测。为简化实验步骤，提高检测效率，本研究采用顶空气相法，通过对前处理条件及色谱条件的统一，同时分离测定了人尿中甲苯和甲醛代谢物，灵敏度高，分析时间短且预处理简单。样品预处理:取尿液2 ml于20 ml顶空瓶中，加1 g释放剂硫酸铵至饱和，加入浓硫酸1 ml和乙醇0.1 ml，封闭后顶空气相自动进样分析。色谱条件:色谱柱为HP-5(30 m ×0.32 mm ×0.25 μm)毛细管色谱柱，FID检测器，载气为高纯氮气，柱流速1 ml/min;柱温40℃，气化室温度150℃，检测器温度300℃;氢气流速30 ml/min，空气流速400 ml/min，尾吹气(氮气)流速25 ml/min;分流进样，分流比:10/1;顶空加热温度70℃，加热平衡时间45 min，进样环温度80℃，传送带温度90℃;进样体积为顶空瓶上部气体1 ml，自动顶空进样。

2.1.5 GC法检测尿样中有机磷代谢产物的含量 参照有关有机磷的检测报道［6］，本研究确定了尿样中有机磷的检测方法。

2.2 HPLC法检测尿样中二恶英代谢产物4，5-DCC的含量 KUMAGAI等人［7］报道指出二恶英代谢产物为4，5-DCC，参照其报道的方法，本研究采用了HPLC方法对尿样中二恶英代谢产物4，5-DCC进行了测定。

2.3 ELISA法检测尿样中AFM1的含量 样品预处理:将尿样用PBS稀释6倍，调整pH为6.5～7.5，4000 g离心5 min后，取上清待用。

3 实验结果

3.1 三甲基氯化锡、盐酸氯丙嗪标准曲线和检测限 TMT在空白尿样中的标准曲线为A=12457 C+2410 .8(R2=0.9919，P ＜0.0001)，线性范围为0.05 ～5μg/ml，定量下限为 0.05 μg/ml。CPZ在空白尿样中的标准曲线为 A=475160 C+9527 .4(R2=0.9983，P ＜0.0001)，线性范围为0.01～1 μg/ml，定量下限为0.01 μg/ml。

3.2 多氯联苯标准曲线和检测限 2-OH-TrCB在空白尿样中的标准曲线为A=116.4C+140(R2=0.9993，P ＜0.0001)，线性范围为0.02～5.0 ng/ml，定量下限为 0.02 ng/ml。4-OH-TeCB在空白尿样中的标准曲线为A=289C+1791 (R2=0.9991，P ＜0.0001)，线性范围为0.02～5.0 ng/ml，定量下限为0.02 ng/ml。4-OH-PeCB在空白尿样中的标准曲线为A=121.5C+198(R2=0.9993，P ＜0.0001)，线性范围为0.02～5.0 ng/ml，定量下限为0.02 ng/ml。

3.3 邻苯二甲酸二丁酯标准曲线及检测限DBP在空白尿样中的标准曲线为A=418.4C+5723 (R2=0.9942，P ＜0.0001)，线性范围为2.0 ～80 ng/ml，定量下限为 2.0 ng/ml。

3.4 二恶英标准曲线及检测限 4，5-DCC在空白尿样中的标准曲线为A=8.514C－1.758(R2=0.9992，P ＜0.0001)，线性范围为 1.0～20.0 μg/ml，定量下限为 1.0 μg/ml。

3.5 甲醛和甲苯标准曲线及检测限 甲醛在空白尿样中的标准曲线为A=102.87C－637.83(R2=0.9958，P ＜0.0001)，线性范围为6.25 ～100 μg/ml，定量下限为 6.25 μg/ml。甲苯在空白尿样中的标准曲线为A=20.58C+0.9928(R2=0.9934，P ＜0.0001)，线性范围为0.16 ～3.22 μg/ml，定量下限为 0.16 μg/ml。

3.6 邻苯二甲酸二丁酯标准曲线及检测限DBP在空白尿样中的标准曲线为A=418.4C+5723 (R2=0.9942，P ＜0.0001)，线性范围为2.0 ～80 ng/ml，定量下限为2.0 ng/ml。

3.7 有机磷标准曲线及检测限 DMP在空白尿样中的标准曲线为A=0.271C－0.023(R2=0.9915，P ＜0.0001)，线性范围为 0.01～0.5 μg/ml，定量下限为 0.01 μg/ml;DEP 在空白尿样中的标准曲线为A=0.716C－0.039(R2=0.9926，P ＜0.0001)，线性范围为 0.01～0.5 μg/ml，定量下限为 0.01 μg/ml;DETP 在空白尿样中的标准曲线为A=0.574C－0.0005(R2=0.9985)，线性范围为 0.01 ～ 0.5 μg/ml，定量下限为0.01 μg/ml;DEDTP在空白尿样中的标准曲线为A=0.430C－0.002(R2=0.9975，P＜0.0001)，线性范围为 0.01 ～0.5 μg/ml，定量下限为 0.01 μg/ml。

3.8 黄曲霉素M1的标准曲线及检测限AFM1标准曲线为:y=－0.4691x+1.3069(R2=0.9966)，线性范围为100～2000 ng/L(图1)，定量下限为100 ng/L。

图1 黄曲霉毒素M1标准曲线Fig.1 Calibration curve of aflatoxin M1

3.9 环境污染物质在人群中的分布 本研究对几种常见环境污染物质在体检人群中暴露水平进行了测定，并且分别对各污染物质的检出浓度及检出人数进行了统计，结果见表1。

4 讨论

本研究中所涉及到的污染物质都是人们日常生活中可能接触得比较多的物质，从结果中可看出，这几类环境污染物质在人体内或多或少都能检测到。甲苯的检出率为33%;四种有机磷中，硫代磷酸二乙酯和二硫代磷酸二乙酯的检出率分别为21.1%和41.2%，而在本次实验的80例体检样本中，磷酸二甲酯只检测到2例，磷酸二乙酯只检测到1例，这些污染物质均可导致各种疾病甚至癌症的发生;多氯联苯和二恶英的检出率比较低，2-羟基-2'，5，5'-三氯联苯和 4-羟基-2'，3，5，5'-四氯联苯检测到 4 例阳性样本，4-羟基-2'，3，3'，4'，5'-五氯联苯、二恶英代谢产物4，5-二氯儿茶酚以及盐酸氯丙嗪在80例样本中均只检测到1例，且检测到的含量较低，而三甲基氯化锡在本次试验中没有被检出;甲醛代谢产物甲酸的检出人数为78例，检出率虽然高达97.6%，但人体正常代谢也能产生甲酸，有文献报道人尿甲酸正常值范围为 6.69 ～39.40 μg/ml［8］。本研究检出的甲酸平均浓度为 8.07 μg/ml，最高浓度为 11.08 μg/ml，在正常值范围内;黄曲霉素M1的检出人数为73例，检出率达到了91.4%。黄曲霉素M1是黄曲霉素的主要代谢物之一，是一类毒性和致癌性很强的化合物，与肝癌的发生有密切的关系［9］，其来源主要是人们对一些发霉的瓜果蔬菜食品的不注意以及对各种谷物和豆类储存不当所致。本课题组还对其他环境污染物质的人群暴露水平进行了测定［10-11］，这些物质包括苯乙醛酸、苯乙醇酸、可的宁、双酚A、乙烯雌酚和沙丁胺醇等，它们同样具有慢性毒性，可不同程度地导致各种疾病的产生［12］。

表1 环境污染物内暴露检测结果Table 1 Results of internal exposure level of environmental pollutants (n=80)

环境污染物对人类健康的潜在威胁不容忽视，一方面，人们应该了解自己体内环境污染物质的暴露水平，养成良好的饮食习惯和生活习性，尽量减少接触那些暴露水平较高的物质;另一方面，需要研究这些环境污染物质对人体的影响，建立安全限值。由于目前存在通量低、成本高等检测技术瓶颈［1］，使得综合评价环境污染物对人体健康影响的研究严重滞后。若能建立一种高通量初筛技术，筛出阳性样本，再结合GC-MS和HPLC等方法定量检测阳性样本的集成检测技术体系，有可能为这个领域的发展带来希望。

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