免疫亲和柱净化-高效液相色谱法测定乳粉中游离叶酸含量

陶大利，姜金斗，*，张永胜

（1.农业部乳品质量监督检验测试中心，黑龙江哈尔滨150090；2.北京博欧实德生物技术有限公司，北京100107）

叶酸（FA）是一种重要的B族维生素，是人和动物为维持正常的生理功能而必须从食物中获得供给的微量有机物质，国际上规定叶酸的日摄入量（RDA）为3mg/kg体重。叶酸缺乏会引起巨幼红细胞贫血、高同型半胱氨酸血症，后者被认为是心血管疾病的独立危险因素[1]。我国在相关标准中规定了婴幼儿配方奶粉与调制乳粉中强化叶酸的量为婴幼儿配方乳粉一般为500～2500μg/kg[2]；儿童用乳粉420～3000μg/kg；孕产妇用乳粉2000～8200μg/kg；其他调制乳粉为2000～5000μg/kg[3]。由于目前国标中采用的微生物法[4]测定技术存在难度大、周期长等问题，建立简单、快速、准确的测定乳粉中叶酸含量的方法有重要现实意义。叶酸分析的主要方法有分光光度法、液相色谱法、微生物法等[5-9]。分光光度法用于叶酸含量较高的药物测定。液相色谱法测定食品或保健品中叶酸一般采用柱后衍生的方法[10-13]，即使采用固相萃取技术净化[14]，对乳粉类样品而言，也因固相萃取净化后的样液中部分干扰物质不能有效去除而干扰叶酸的定量测定。2010年发布的乳品标准微生物法也因测定周期长、技术难度大、重现性差等缺点，只有极少数质检机构采用。液相色谱-质谱联用技术的应用在食品中叶酸测定中已有报道[15]，虽灵敏度高于液相色谱法，但回收率也不理想。而近年来免疫亲和净化技术对处理复杂基质的样品用于仪器分析的优势越来越明显[16-18]。本实验拟以叶酸免疫亲和柱净化、己烷磺酸钠为离子对试剂，无需柱后衍生，建立了反相高效液相色谱法测定乳粉中叶酸含量的方法。其中将免疫亲和柱净化用液相色谱分析用于乳粉样品中叶酸测定是一个创新，目前文献中还未见有类似的报道。此方法可以满足乳品企业出厂检验与品控及质监部门监督的需要。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甲醇 色谱纯；pH7.4磷酸盐缓冲液 分别称取1.24g KH2PO4（分析纯）、7.27g K2HPO4（分析纯）和8.76g NaCl（分析纯）溶解于1L去离子水中，调pH至7.4；离子对-醋酸溶液 称取20mg己烷磺酸钠，吸取10mL冰乙酸、1.3mL三乙胺后定容至1L，用磷酸调到pH3.2，用0.45μm滤膜过滤；叶酸标准品标准品（纯度大于98%） 美国Sigma公司；Biotez叶酸免疫亲和柱美国Biotez公司，柱容量为500ng叶酸。

2695型高效液相色谱仪、2489型双通道紫外检测器 美国Waters公司；3-30K型高速冷冻离心机 德国Sigma公司；SPE型固相萃取装置 美国Supelco公司；N-EVAP112型氮吹仪 美国Organomation公司。

1.2 样品处理

1.2.1 样品提取 称取样品2g（精确至0.1mg）置于锥形瓶中，用pH7.4磷酸盐缓冲液50mL溶解样品后，超声提取10min。将样液移入50mL离心管中以5000r/min离心10min，去除上层脂肪后取10mL置于锥形瓶中加入30mL pH7.4磷酸盐缓冲液混匀。

1.2.2 免疫亲和柱净化与富集 将免疫亲和柱置于固相萃取装置上，放出柱中的保存液后将40mL样液以不超过2mL/min的速度全部通过小柱后排空，再用20mL pH7.4磷酸盐缓冲液冲洗小柱并抽干残存的洗涤液。将样品收集瓶放于小柱下方后向小柱中加入1mL甲醇，待甲醇到达小柱底部后关闭活塞静止1min，然后再加入2mL甲醇以不超过2mL/min的速度全部通过小柱，并排干小柱中的残留液体。将洗脱液用氮吹仪吹至近干后取下，再用去离子水定容至2mL，通过0.45μm滤膜。

1.3 色谱条件

色谱柱：Waters C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；柱温：35℃；流速：1.0mL/min；进样量：100μL；流动相：离子对-醋酸溶液：甲醇（80∶20，V/V）。

2 结果与讨论

2.1 样品处理的优化

由于婴幼儿乳粉及调制乳粉中成分复杂，蛋白质及脂肪含量较高，干扰物质较多等，为防止蛋白质等对免疫亲和柱净化时产生干扰，采用了高氯酸、亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液、硫酸锌溶液及调pH4.6四种沉淀蛋白的方法。由于免疫亲和柱适宜的pH为7.4左右，为此将上述过滤液分别将酸度调至pH7.4后过柱。通过进行回收率的测定后发现，上述四种方法叶酸的回收率都在65%以下，证明这四种处理方法都不可行。究其原因可能是由于在蛋白沉淀过程中部分叶酸被蛋白质吸附或包裹造成损失及样液酸碱体系不稳定影响与抗体的结合等所致。为此根据免疫亲和柱的特点，我们采用缓冲溶液使样液的酸度稳定在适宜范围；其次根据专一性强、不对蛋白吸附的特点在不去除蛋白质的情况下直接过柱净化。经实验证明，若样液不去除脂肪，由于脂肪对抗体表面的掩盖作用会造成结果偏低；若通过离心去除脂肪后的样液直接过柱，也会因样液较为粘稠造成堵塞而难以过柱；而通过样液与缓冲溶液1∶3稀释后再过柱即可以解决堵塞问题，也可解决脂肪对叶酸与抗体结合的影响。通过回收及样品测定后证明，此处理方法样品回收率达90%左右，样品实际测定值符合基本实际添加量，其精密度较好。

2.2 免疫亲和柱性能的测定

为验证免疫亲和柱的性能，本实验设计了不同上样量、不同吸附洗脱的速度测试，通过测定回收率进行了最佳净化条件的考察。首先采用含有300ng的标准叶酸溶液按1、2、3、4、5mL/min吸附、洗脱相同的速度进行测试，证明当流速高于2mL/min时其效果显著下降；当流速≥4mL/min时，回收率低于50%，说明流速过快对吸附洗脱效果影响显著，见表1。之后选用不同上样量以2mL/min的吸附洗脱速度测试的回收率均在97%以上，证明该免疫亲和柱性能优良，见表2。

表1 不同吸附洗脱速度对叶酸测定结果的影响Table 1 The effect of adsorption elution speed on folic content measurement

表2 叶酸免疫亲和柱性能验证结果Table 2 The folic acid immunoaffinity column performance verification results

2.3 色谱条件的优化

为达到分离效果好、基线噪声低、灵敏度高的目的，根据文献直接采用紫外检测器280nm波长进行检测。本实验（除流动相外，色谱条件采用1.3）重点对4种流动相进行了优化：a.12%乙腈+88%0.05mmol/L磷酸二氢钾溶液（pH=3.5）[5-6]；b.35mL乙腈+965mL 0.05mol/L KH2PO4缓冲盐（pH=5.0）[7]；c.0.05mol/L KH2PO4-0.01mol/L四丁基溴化铵-乙腈（88∶2∶10，V/V），磷酸调节pH5.5[1]；d.（20mg己烷磺酸钠+10mL冰乙酸+1.3mL三乙胺后定容至定容1L，pH3.2）：甲醇（80∶20，V/V）。实验表明，流动相a、b采用的是缓冲盐，叶酸保留时间过长，与样品中的杂质不能有效分离；流动相c、d采用的是离子对分离模式，都可以分离叶酸（见图1），但流动相d的分离效果稍好且保留时间在10min左右，样品净化后待测物附近无杂质干扰、灵敏度高，故本实验的选择流动相d，见图2。

图1 婴儿配方奶粉中叶酸色谱图（流动相c）Fig.1 Chromatograms of folic acid in infant formula milk powder（mobile phase c）

图2 婴儿配方奶粉中叶酸色谱图（流动相d）Fig.2 Chromatograms of folic acid in infant formula milk powder（mobile phase d）

2.4 线性范围与检出限

在上述的最佳色谱条件下，根据乳粉中叶酸含量范围及样品处理方法，配制成叶酸标准工作液为50、100、150、200、300μg/L系列浓度，采用外标峰面积法定量。经测定，在该系列浓度范围内呈良好的线性关系，线性回归方程为y=-185.68+290.29x（y为峰面积；x为浓度，μg/L），相关系数R2=0.9997（见图3）。用婴儿配方奶粉样品处理液测定峰面积，以本底3倍噪音计算样品最低检出限为40μg/kg。图4为100ng/L浓度的叶酸标准样品色谱图，由图4中可看出，在低浓度时叶酸色谱图的保留时间、峰形、峰高等参数都等满足测定需要。

图3 叶酸标准曲线Fig.3 Folic acid standard curve

图4 叶酸标准品色谱图Fig.4 Folic acid standard chromatogram

2.5 方法的回收率和精密度

分别选取婴儿配方奶粉与儿童奶粉添加叶酸标准溶液后进行样品处理，测定回收率；将婴幼儿配方乳粉与儿童乳粉分别称取6份按1.2方法处理后上机进行精密度测定。两样品不同添加量回收率在84%～92%之间，平均为88.2%，两个样品平均RSD为1.99%。回收率与精密度测定结果分别见表3、表4。

表3 样品中叶酸回收率测定结果Table 3 Recovery rates of folic acid measurement results

表4 样品叶酸精密度测定结果Table 4 Determination precision（RSD）of folic acid in sample

由方法回收率与精密度实验结果表明，对于含有微量成分样品的定量测定而言，回收率在80%以上完全能满足定量测定的要求；同时精密度实验的RSD%优于国标的相关标准的要求（10%）[4]。此方法准确、性重现性好。

3 结论

3.1 本实验建立了婴幼儿配方乳粉与调制乳粉中叶酸的免疫亲和柱净化富集、高效液相色谱测定方法。该法具有样品处理简单、测定周期短、灵敏度高等优点。

3.2 通过对叶酸免疫亲和柱性能的测试，吸附洗脱速度应控制在2mL/min以内；不同标准浓度叶酸回收率在97%～98%间，性能可靠。

3.3 通过对样品前处理方法的优化，确定了采用缓冲液处理、离心脱脂、免疫亲和柱净化及富集的方法，无需沉淀去除蛋白质，从而解决了采用液相色谱法测定叶酸干扰而影响定量的问题。最低检出限为40μg/kg。

3.4 该方法线性范围好，在50～300μg/L的范围内呈良好的线性关系。回归方程为y=-185.68+290.29x，相关系数R2=0.9997。

3.5 样品加标回收率在84%～92%间，平均为88.2%；样品6次测定结果RSD为1.39%，完全能满足微量成分定量测定的要求。

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