钙周期素结合蛋白的细胞周期依赖性转位现象

陈 阳, 白 薇, 刘崇霞, 杨 芳, 路国华, 王晓明, 李 源, 宁晓暄

（第四军医大学西京医院老年病科, 西安 710032）

钙周期素结合蛋白（calcyclin-binding protein，CacyBP/SIP）最初是由Filipek等人在小鼠艾氏腹水细胞瘤中作为S100A6的靶蛋白而发现[1]，而后通过序列分析发现其与siah-1结合，称作SIP（siah-1 interacting protein），二者具有93%同源性，所以SIP即为人CacyBP/SIP[2]。CacyBP/SIP可与S100A6、Siah-1、Skp1、微管蛋白、细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）等分子结合，并且参与了组织细胞分化和抑制肿瘤细胞生长、增殖的作用。研究发现在神经元细胞中CacyBP/SIP还存在细胞内钙浓度依赖的核转位现象。本研究将在胃癌细胞中观察CacyBP/SIP的亚细胞定位与细胞周期的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

人胃癌细胞SGC-7901（为第四军医大学西京医院老年病科实验室长期保存）。

1.2 试剂和仪器

RPMI1640（美国赛默飞世尔公司）；胎牛血清（美国Gibco公司）；FITC标记抗鼠（北京中杉金桥公司）；鼠抗CacyBP（美国Santa Cruz公司）；Lamin-A多克隆抗体（美国ProteinTech公司）；BCA蛋白定量试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）；同步化试剂胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine，简称胸苷，美国sigma公司）；核蛋白提取试剂盒（碧云天公司）。流式细胞仪（美国赛默飞世尔公司）；荧光显微镜（日本奥林巴斯公司）；孵箱（美国赛默飞世尔公司）。

1.3 细胞同步化

取对数生长期的细胞用0.25%胰酶消化，以2×108细胞/L的密度铺于6孔板中，37℃，5%CO2孵箱中培养；待细胞50%融合时，在完全培养基中加入同步化试剂胸苷，使其终浓度为2mmol/L，继续培养16h；弃去培养液，更换无药新鲜培养基，5%CO2、37℃继续培养8h；再加入终浓度为2mmol/L的胸苷，继续培养16h；弃培养基，洗涤细胞2次，更换新鲜培养基进行释放，分别于0，4，8，12，16h用0.25%胰酶消化并获取细胞；PBS洗涤细胞2次；加入无水乙醇固定，上流式细胞仪进行细胞周期的检测。

1.4 免疫荧光染色

取对数生长期的细胞进行计数并调整密度至2～3×107细胞/L，接种于无菌盖玻片上，37℃、5%CO2培养24～36h后进行细胞同步化，同时设只加入等药体积无血清培养基的无药对照组，在同步化后不同时间段，取出盖玻片，PBS冲洗3次，无水乙醇固定；PBS冲洗细胞爬片3次，5min/次，0.3%Trtion-X-100通透细胞20min，PBS冲洗细胞爬片3次，5min/次，山羊血清室温封闭1h；在细胞爬片上加入抗CacyBP/SIP抗体，放入湿盒中4℃过夜，第2日室温复温1h，PBS冲洗细胞爬片3次，5min/次；加FITC标记的羊抗鼠二抗，湿盒中室温封闭1.5h；PBS冲洗3次，5min/次，DAPI染核3min；PBS冲洗3次，5min/次，防荧光淬灭剂封片，上机观察。

1.5 核蛋白提取

参考碧云天公司细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒说明书。

1.6 Western印记法

配置10%的下层胶和5%上层胶，根据不同蛋白浓度调整上样量，进行聚丙烯氨凝胶电泳。凝胶于电泳缓冲液中25mA，40min进行电泳，用半干转移系统将蛋白转移到NC膜上。用丽春红染液对NC膜染色，标记蛋白分子量标准各条带位置，按照目的蛋白大小剪膜。将剪好的NC膜放入用TBST配置的5%脱脂牛奶中室温封闭1h。一抗为鼠抗CacyBP/SIP抗体，1∶200稀释于5%脱脂牛奶中，4℃孵育过夜。1倍TBST摇洗NC膜3次，5min/次。HRP标记的二抗1∶1000稀释于5%脱脂牛奶中，室温孵育1h。1倍TBST摇洗NC膜3次，5min/次，最后ECL显色。

1.7 统计学处理

采用SPSS16.0软件进行LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 细胞周期同步化

经过双胸苷阻滞法进行细胞周期同步化使其阻滞在G1期，而后进行释放，在不同时间段提取细胞，并利用流式细胞仪进行检测。在释放0，4及16h，细胞主要处于G1/S期，8，12h时则主要处于G2期（图1）。

2.2 免疫荧光染色

经过双胸苷阻滞法对胃癌细胞SGC7901进行处理，使其阻滞在G1期，而后释放，分别在释放0，4，8，12，16h时，利用免疫荧光染色后，荧光显微镜观察CacyBP/SIP分子的亚细胞定位。结果显示，实验组CacyBP/SIP在细胞周期同步化0，4，16h时（以G1/S期细胞为主）主要分布在胞浆中（图2 A、B和E），而在8h定位于核周，12h时则进入核内（图2 C和D，以G2期细胞为主），提示CacyBP/SIP存在细胞周期依赖的定位变化。而对照组在相同时间段并无入核转位现象（图2C'和D'）。

2.3 Western印记法

将胃癌细胞SGC7901利用胸苷进行同步化后，分别在0，4，8，12，16h提取总蛋白与核蛋白，Western印记法检测CacyBP/SIP的表达水平，在细胞周期的不同时期，CacyBP/SIP的总蛋白并无明显变化（P＞0.05；图3）。核蛋白表达水平在8，12h有所增高，与0，4，16h相比差异有统计学意义（P＜0.05；图4）。Western印记法结果进一步证实，CacyBP/SIP在胃癌细胞的G2期时发生了核转位。

图1 细胞周期同步化效果Figure 1 Effect of cell cycle synchronization

3 讨 论

Filipek等在1996年从小鼠艾氏腹水细胞瘤中发现一个新分子，并命名为CacyBP/SIP，其分子量大小约30ku，编码229个氨基酸。CacyBP/SIP在脾脏及脑中高表达，肝、胃及心脏中呈中等程度表达，淋巴结、结肠及肾脏中则呈低水平表达[1,3]。CacyBP/SIP不但可以配体形式与S100A6结合，而且还与S100家族中其他一些蛋白结合，例如S100A1、S100A2、S100B、S100P[4]。

在对小鼠神经细胞瘤NB2a及人神经细胞瘤SH-SY5Y研究中发现，当细胞内钙离子浓度升高时，CacyBP/SIP分子可以从胞浆向胞核及核周转位。进一步研究证实，CacyBP/SIP的这种钙依赖核转位现象是由于丝氨酸磷酸化所致[5]。目前已知，CacyBP/SIP与细胞的分化、增殖等有着密切的联系。研究发现，CacyBP/SIP与ERK1/2结合可以使得Elk-1的转录活性降低，影响细胞的分化，并且可与微管蛋白结合并参与细胞的骨架重构[6]。在神经元衰老过程中，CacyBP/SIP还发生了定位变化，这可能与其自身磷酸化或与磷酸化微管蛋白的结合有一定关系[7]。p27蛋白不仅参与细胞周期的调节，还影响细胞迁移，而Nagano等[8]发现CacyBP/SIP可以通过降解成纤维细胞中p27蛋白，从而降低细胞的迁移能力。另有研究表明，抑制子宫基质细胞中CacyBP/SIP的表达可以抑制细胞凋亡，从而使得细胞生长能力明显提高[9]。而CacyBP/SIP基因缺失的淋巴细胞会出现pre-TCR检测点受损，不能进行TCRβ基因重排，而且凋亡增加，进而导致胸腺细胞数减少[10]。

CacyBP/SIP与Siah-1、Skp1、Ebi结合形成泛素连接酶复合物，参与了非磷酸化β-catenin的降解。β-catenin是Wnt信号通路的关键分子，在肿瘤的发生、侵袭和转移中有重要作用[11]。因此，我们首先研究了CacyBP/SIP在胃癌细胞发生中的作用，结果发现，CacyBP/SIP上调可以抑制胃癌细胞的生长和成瘤性，降低胃癌细胞的侵袭力，可诱发胃癌细胞凋亡[12]。我们的进一步研究显示，S100A6与CacyBP/SIP结合可以负向调控CacyBP/SIP对β-catenin的降解作用[13]。此外，我们还发现CacyBP/SIP在肾癌细胞及肾癌组织中的表达显著低于正常的肾小管上皮细胞和癌旁组织。上调肾癌细胞中CacyBP/SIP可以通过促进β-catenin的降解进而影响cyclin D1的转录，导致肾癌细胞发生G1期阻滞[14]。

由于泛素化降解途径在细胞周期的调控中发挥重要作用，所以我们推测CacyBP/SIP可能从不同途径参与细胞周期的调控。为此我们首先研究了CacyBP/SIP在细胞周期中的定位。我们用双thymidine阻滞法使胃癌细胞SGC7901有效阻滞于G1/S期，并在8和12h主要进入G2/M期。免疫荧光显示，CacyBP/SIP在G1/S期主要定位于胞浆，G2期发生转位并定位于核周及核内。而对照组在相同时间段并无CacyBP/SIP的核转位现象，这说明观察的结果与双thymidine阻滞法的处理有关。通过对细胞核蛋白的检测进一步证实CacyBP/SIP在G2期进入胞核，表明CacyBP/SIP存在细胞周期依赖的转位现象。另外，在各细胞周期中CacyBP/SIP总蛋白表达无明显变化，提示CacyBP/SIP并未有细胞周期相关的表达改变，只是定位变化。目前CacyBP/SIP在细胞周期的定位及其作用还未见文献报道，其调控机制还不清，我们推测CacyBP/SIP可能通过以下机制调控细胞周期G2/M期：（1）泛素连接酶活性的变化：CacyBP/SIP向核周及胞核转位后，发生磷酸化，同时泛素连接酶的活性增强，从而降解细胞周期相关分子；（2）通过定位变化使特定部位的蛋白降解：CacyBP/SIP向核周及胞核转位后，可能引起核周和胞核中一些蛋白的降解；（3）定位变化可能使与其结合的某些蛋白进入特定部位发挥作用：CacyBP/SIP可以与微管蛋白发生结合，将其携带至细胞核，使微管蛋白在胞核聚合成微管而发生作用。上述的推测还需进一步证实。另外CacyBP/SIP是否受到细胞周期相关激酶的调控而发生转位也需要深入研究。CacyBP/SIP是细胞周期调控分子，可能通过蛋白降解或其他途径影响细胞分裂周期，特别是G2/M期，从而参与细胞周期的调控，进而影响胃癌细胞的增殖。

综上所述，CacyBP/SIP可能是一种细胞周期调控分子，可能通过多种途径影响细胞周期进程，进而参与了细胞的多种病理生理活动,但其更多的生物学功能仍需要更进一步研究。

图2 细胞周期对CacyBP/SIP细胞内定位的影响Figure 2 Influence of cell cycle on intra-cellular location of CacyBP/SIP (×40)

图3 细胞周期对CacyBP/SIP总蛋白表达的影响Figure 3 Influence of cell cycle on expression of total CacyBP/SIP protein

图4 细胞周期对CacyBP/SIP核蛋白表达的影响Figure 4 Influence of cell cycle on expression of nuclear CacyBP/SIP protein

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